Tof2 - ein nukleolarer Aktivator der Phosphatase Cdc14 unterstützt die rDNA Trennung in S. cerevisiae

摘要

Die Phosphatase Cdc14 ist ein wichtiger Regulator der Mitose in der Hefe S. cerevisiae. Cdc14 gehört zur Familie der Ser/Thr Phosphatasen und ist bis zum Menschen konserviert. In S. cerevisiae ist Cdc14 essentiell für den Austritt aus der Mitose. Durch seine Phosphatase Aktivität wirkt Cdc14 den Phosphorylierungsereignissen der zyklinabhängigen Kinase Cdc28 entgegen und ist an deren Inhibition und dem Abbau mitotischer Zykline am Ende der Mitose beteiligt. Weitere Ereignisse, die am Ende der Mitose von Cdc14 vermittelt werden, sind die Stabilisierung der Spindel, die Positionierung des Zellkerns, die Trennung der rDNA und die Einleitung der Zytokinese. Die Aktivität der Phosphatase muss daher für einen korrekten Ablauf des Zellteilungszyklus streng reguliert werden. Cdc14 wird bis zur Metaphase über den N-terminalen Teil von Net1 im Nukleolus verankert und somit inhibiert. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Cdc14 und Net1 Teil eines größeren Netzwerks nukleolarer Proteine darstellen, das auch das Net1-verwandte Protein Tof2 enthält. Tof2 ist am regionspezifischen rDNA-silencing beteiligt, seine genaue zelluläre und molekulare Funktion ist jedoch noch weitestgehend unverstanden. Aufgrund der 30%-igen Sequenzidentität des N-terminalen Bereichs von Tof2 zu dem für die Cdc14 Verankerung und Inhibition verantwortlichen N-terminalen Bereich von Net1 sollte eine mögliche Verbindung von Tof2 und Cdc14 analysiert werden.Über indirekte Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, dass Tof2 während des gesamten Zellteilungszyklus im Nukleolus lokalisiert. Weiterhin machten in vivo Interaktionsstudien deutlich, dass die nukleolaren Proteine Tof2, Cdc14 und Net1 in einem gemeinsamen Komplex vorliegen und der N-terminale Teil von Tof2 notwendig und hinreichend ist für die Assoziation mit der Phosphatase. In einer in vitro Interaktionsstudie war es außerdem möglich, die direkte Bindung von Cdc14 an den N-terminalen Bereich von Tof2 nachzuweisen. Aufgrund der Ähnlichkeiten von Tof2 und Net1 innerhalb ihrer N-terminalen Sequenzen und der Interaktion mit Cdc14, wurde auf die Ähnlichkeit ihrer Funktionen in vitro und in vivo getestet. In vitro Messungen der Phosphatase Aktivität zeigten, dass Tof2 anders als Net1 kein Inhibitor der Phosphatase Cdc14 ist, sondern deren Aktivität stimuliert. Auch in vivo verhielt sich Tof2 nicht wie ein Inhibitor der Phosphatase, im Unterschied zu Net1 unterstützt Tof2 die biologische Funktion von Cdc14. Analysen einer tof2-Deletionsmutante ergaben eine größtenteils normale Progression durch den Zellteilungszyklus mit einer marginalen Verzögerung der Anaphase/Telophase und Zytokinese. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Nukleolustrennung in der Deletionsmutante beeinträchtigt ist. Lokalisationsstudien des etablierten nukleolaren Markers Net1 in einer asynchronen Kultur von tof2-Deletionsmutanten machten deutlich, dass über 50% der analysierten Anaphase Zellen eine asymmetrische Verteilung des Nukleolus bzw. nukleolare Brücken zwischen den bereits weit voneinander getrennten Kernen zeigten. Eine zeitliche Abschätzung ergab, dass Mutanten, die eine Deletion von TOF2 aufweisen, circa 50 Minuten benötigten, um ihre rDNA komplett zu trennen, während sich diese Zeit bei dem Kontrollstamm auf 25 Minuten berechnen ließ. Analysen synchroner Kulturen bestätigten die verzögerte Trennung des Nukleolus in der tof2-Deletionsmutante. Der Prozess der Kompaktierung und Trennung der rDNA wird durch Condensin vermittelt, das in einer Cdc14-abhängigen Weise während der Anaphase an der rDNA lokalisiert. Diese nukleolare Lokalisation des heteropentameren Condensin-Komplexes während der Anaphase wurde über indirekte Immunfluoreszenz der Condensinuntereinheit Smc4 untersucht. Es wurde deutlich, dass Smc4 in der tof2-Deletionsmutante während der Anaphase nicht nur auf den Nukleolus beschränkt ist sondern auch im Zellkern und Nukleoplasma lokalisiert.All diese Daten zusammengenommen weisen darauf hin, dass Tof2 Cdc14 in vivo unterstützt und zwar dahingehend, dass es die Rekrutierung von Condensin an die rDNA während der Anaphase erleichtert und somit zu einer korrekten Trennung der rDNA beiträgt. Dies könnte dadurch bewerkstelligt werden, dass Tof2, das auch während der Anaphase im Nukleolus lokalisiert, einen Pool von aktivem Cdc14 in dieser Phase des Zellzyklus an der rDNA zurückhält. Dadurch wäre es Cdc14 möglich auf bestimmte Zielproteine an der rDNA zu wirken, um diese auf eine erfolgreiche Bindung von Condensin vorzubereiten.