Etablierung eines in-vitro-Modells zur gemischten Adipogenese und Osteogenese von humanen mesenchymalen Stammzellen und der Einfluss von 17-ß-Östradiol auf die gemischte Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen

摘要

HINTERGRUND:udZellbiologische Veränderungen unter dem Einfluss von Stressfaktoren bei der adipogenen und osteogenen Differenzierung von hMSCs wurden bisher in Monokulturen untersucht. Um interzelluläre Einflüsse mit einzubeziehen, wurde ein in-vitro Modell für gemischte Adipo-und Osteogenese entwickelt und anschließend auf den Einfluss von 17-ß-Östradiol hin angewendet.ududMETHODEN: udHumane mesenchymale Stammzellen wurden aus dem Beckenkamm isoliert und proliferiert. Um die geeignete Zusammensetzung der Medien für sowohl osteogene und adipogene 2D-Differenzierung als auch eine ausgewogene gemischte Kultur zu erhalten, wurden die hMSCs mit rein adipogenen (Dex 10E-6M, Insulin 1-5 µg/ml,IBMX 0-0,5 mM) und osteogenen (Dex 10E-8M, Asc 50 µg/ml, ßGP 5mM, Vit D3 1-10 nM) Zusätzen differenziert. Auch bei der gemischten Kultur wurde mit den Supplementen variiert (Dex 10E-7, Asc 50 µg/ml, ßGP 5mM, Vit D3 1-10 nM, Insulin 1-5 µg/ml, IBMX 0-0,5 mM). Die Auswertung bezüglich der Modelletablierung erfolgte histologisch (Alizarin Red, Oil Red O) und biochemisch (Alkaline Phosphatase-Aktivität, Ca-Bestimmung mittels Alizarin Red, DNA-Quantifizierung, G3PDH-Aktivität). Der Einfluss von 17ßÖstradiol in den Konzentrationen 10E-12, 10 E-10, 10E-8 wurde zusätzlich mittels quantitativer Real-Time PCR bezüglich der oceocalcin-, runx2v3-, ppary- und LPL-Expression untersucht, welche zu hprt normiert wurde. ududERGEBNISSE:udEine optimale Osteo-und Adipogenese sowie gemischte Differenzierung ergab sich histologisch (Alizarin Red, Oil Red O) und biochemisch (Alkaline Phosphatase-Aktivität, Ca-Bestimmung mittels Alizarin Red, DNA-Quantifizierung, G3PDH-Aktivität) mit Dex 10E-7, Asc 50 µg/ml, ßGP 5mM, Insulin 5 µg/ml, IBMX 0,5 mM.ud17-ß-Östradiol fördert konzentrationsabhängig die Adipogenese in rein adipogener Differenzierung (phänotypisch, genetisch, biochemisch). Die G3PDH-Aktivität in rein adipogener Differenzierung ist ausgeprägter als in gemischter Differenzierung. Die Adipogenese ist in gemischter Differenzierung reduziert. Eine eindeutige Hormonabhängigkeit bei reiner Osteogenese ist nicht nachzuweisen gewesen. Bei gemischter Differenzierung verschiebt sich das Gleichgewicht verstärkt in Richtung Osteogenese, wobei diese in gemischter Kultur früher beginnt als bei rein osteogener Differenzierung. ududDISKUSSION:udEine gleichtzeitige adipogene und osteogne Differenzierung von hMSCs nebeneinander ist möglich. Dies bietet die Möglichkeit, grundlegende Mechanismen unter dem Einfluss von Stressfaktoren in der Biologie der hMSCs zu untersuchen.udÖstrogen scheint die Adipogenese zu förden. Ein positiver Effekt im Rahmen der Osteogenese konnte in diesem Modell nicht gezeigt werden. udBei gemischter Differenzierung verschiebt sich das Gleichgewicht Richtung Osteogenese ohne eindeutigen Hormoneinfluss. ud