Die erste Struktur eines Zellwandproteins einer Diatomee: NMR-spektroskopische Charakterisierung der PSCD4-Domäne von Pleuralin-1 aus Cylindrotheca fusiformis unter Verwendung von Methoden zur partiellen Orientierung

摘要

In dieser Arbeit wurde die erste Struktur eines Zellwandproteins einer Kieselalge mit Flüssigkeits-NMR-Spektroskopie bestimmt: Die Struktur der PSCD4-Domäne des Zellwandproteins Pleuralin-1 aus Cylindrotheca fusiformis. Die PSCD-Domänen (87 bzw. 89 AA) sind hoch konserviert und wurden nur in den Mitgliedern der Pleuralin-Familie (früher HEP) gefunden. Der Name PSCD bezieht sich auf die am häufigsten vorkommenden Aminosäuren (~22% Pro, ~11% Ser, ~11% Cys und ~9% Asp). Während die PSCD-Domänen 70% bis 92% Sequenzidentität untereinander aufweisen, zeigen sie keine signifikante Homologie zu anderen Proteinen in den gängigen Datenbanken. Aufgrund der ungewöhnlichen Aminosäurezusammensetzung erwarteten wir ein neues Faltungsmotiv, welches das PSCD4 auch tatsächlich ausbildet.Aufgrund der signifikanten Abweichungen der chemischen Verschiebungen von den Random-Coil-Werten, scheint der Kern der Domäne gut strukturiert zu sein. Allerdings deuten die Analysen der chemischen Verschiebungen mit den Computerprogrammen CSI und TALOS darauf hin, dass PSCD4 keine kanonischen Sekundärstrukturelemente ausbildet. Die Bestimmung der Struktur in Lösung wurde durch die relativ geringe Anzahl an beobachtbaren NOE-Kontakten erschwert. Des Weiteren kommt es, aufgrund des Überwiegens weniger nicht aromatischer Aminosäuren, zu vielen Überlagernungen in den Spektren. Um diese Hindernisse zu umgehen, wurde die Position von drei der fünf Disulfidbrücken, ihre Existenz ist anhand ihrer chemischen Verschiebungen gezeigt, mit biochemischen Methoden, wie enzymatische Spaltung, HPLC-Analyse, Massenspektroskopie und Edman-Abbau bestimmt. Zusätzlich zu den Positionen der Disulfidbrücken und den Abstandsinformationen aus den NOESY-Spektren wurden Restdipolkopplungen zwischen dem HN und N gemessen, welche sehr wertvolle Strukturinformationen enthalten. Informationen über den Diederwinkel F wurden dem HNCA-E.COSY-Spektrum entnommen. Wasserstoffbrückenbindungen wurden mittels des modifizierten HNCO-Experiments direkt nachgewiesen. Die Struktur der PSCD4-Domäne, ebenso wie ein Modell aller fünf PSCD-Domänen aus Pleuralin-1 wurde mittels Simulated Annealing mit dem Computerprogramm CNS berechnet.Der Kern der PSCD4-Struktur enthält keine klassischen Sekundärstrukturelemente und zeigt ein neues Faltungsmotiv. Er besteht aus mehreren Schleifen, welche durch die fünf Disulfidbrücken verbunden sind. Der RMSD des Kerns ist 0,109 nm (Proteinrückgrat, Reste 30 bis 80). Die aus dem Ramachandran-Diagramm bestimmte Auflösung der Struktur ist 0,4 nm. Die zwei Termini sind flexibel, was durch die Relaxationsuntersuchungen bestätigt wurde. Mit dem Computerprogramm Dali konnte gezeigt werden, dass es in der PDB-Datenbank keine der PSCD4-Domäne ähnlichen Strukturen gibt. Deshalb ist anzunehmen, dass die PSCD4-Domäne einen neuen Faltungstyp besitzt.Aufgrund dieser Struktur kann über die Funktion des Proteins spekuliert werden. Die gesamte Oberfläche ist aufgrund von sauren Seitenketten von 12 Asparaginen und Glutamaten negativ geladen, mit Ausnahme zweier basischen Bereiche. Wie Studien zur Immunlokalisation (KRÖGER & WETHERBEE, 2000) und die Zugänglichkeit für den Abbau mit Pronase (KRÖGER et al., 1997) zeigen, ist Pleuralin-1 auf der Oberfläche der Zellwand dem umgebenden Wasser exponiert. Da die PSCD4-Domäne in Lösung nicht aggregiert, kann man spekulieren, dass die fünf PSCD-Domänen des Pleuralin-1 wie Perlen auf einer Schnur aufgereiht sind, verbunden durch verschieden lange Peptide. Diese Annahme wird von den Modellrechnungen für ein Protein aus allen 5 PSCD-Domänen bestätigt. Auf der Oberfläche der PSCD-Domäne ist eine große Anzahl potentiell modifizierbarer funktioneller Gruppen, wie die Seitenketten von Asparaginen, Serinen und Threoninen. diese können kovalent mit anderen organischen Komponenten der Zellwand, z.B. Oligosacchariden verknüpft sein. Solche Verknüpfungen könnten die Morphologie der Zellwandbildung kontrollieren (KRÖGER & WETHERBEE, 2000).In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde eine Methode zur genauen Messung von HN-Ha-Restdipolkopplungen an unmarkierten Proteinen etabliert. Das MOCCA-SIAM-Experiment erlaubt die Bestimmung von Kopplungskonstanten mit weit höherer Genauigkeit und höherer Sensitivität als das COSY-Experiment. Der Fehler für die Restdipolkopplungen ist bei guter Spektrenqualität ±0,4 Hz. Dadurch können die Restdipolkopplungskonstanten auch bei geringeren Orientierungsgraden gemessen werden und Untersuchungen zur Orientierung im Magnetfeld, wie hier für das HPr gezeigt, durchgeführt werden.Aufgrund der höheren Qualität der Spektren, gegenüber dem COSY, erlaubt das MOCCA-SIAM-Experiment die Bestimmung von HN-Ha-Restdipolkopplungen mit negativem Vorzeichen. Die Qualität der mit dem MOCCA-SIAM-Experiment bestimmten Restdipolkopplungen wurde am BPTI überprüft, wobei sich für 19 HN-Ha-Restdipolkopplungen innerhalb der Sekundärstrukturelemente ein Qualitätsfaktor Q = 0,286 ergab.