Plasmid basierte DNA-Vektor-Systeme; Aktivierung der angeborenen Immunität durch Modulationen im Vektor-Rückgrat und Einsatz in der Gentherapie

摘要

Plasmid DNA (pDNA) basierte Vektorsysteme stellen auf Grund ihres hohen Sicherheitspotentials sowie der fehlenden Induktion einer Vektor-spezifischen Immunantwort eine vielversprechende Alternative zu viralen- bzw. Virus-assoziierten Vektorsystemen dar. Trotz dieser Vorteile ist der Einsatz von pDNA-Vektoren sowohl für die genetische Immunisierung als auch in der Gentherapie vor allem durch die Notwendigkeit der Verabreichung sehr hoher DNA-Mengen sowie zeitlich begrenzter Transgen-Expression limitiert. Im Hinblick auf das rationale Design von pDNA-Vektoren ist bislang zudem wenig hinsichtlich deren Aktivierung des angeborenen Immunsystems über CpG-Motive im Vektorrückgrat bekannt � im Falle eines Immunisierungsvektors wäre diese Aktivierung von Vorteil, während ein in der Gentherapie eingesetztes Plasmid immunologisch neutral sein sollte. udIm ersten Teil der Arbeit wurde daher der Einfluss des Gehaltes und des Kontextes von CpG-Sequenzen im Vektorrückgrat auf die Aktivierung des angeborenen Immunsystems untersucht. Die Reduktion des CpG-Gehaltes des immunologisch neutralen Ausgangsvektors pRS auf 50,6% (pdeltaS) führte nach Stimulierung naiver Maus-Splenozyten zu einer starken Sekretion proinflammatorischer Cytokine mit einem klaren Th1-Profil. Das erhöhte mitogene Potential des pdeltaS-Vektors ließ sich auch nach Stimulierung humaner plasmazytoider Dendritischer Zellen durch die starke Freisetzung von IFNalpha nachweisen. Die zufällige Deletion eines 110 bp Fragments im pUCori des pdeltaS-Vektors führte zu einem Verlust seiner mitogenen Eigenschaften. Anhand diverser Mutanten konnte gezeigt werden, dass immunstimulatorische Eigenschaften der 110 bp-Region von der Lokalisierung und dem Sequenzkontext der im Fragment enthaltenden CpGs abhängig sind. Durch vergleichende Studien konnte zudem anhand von knockout Mäusen gezeigt werden, dass die immunstimulatorischen Eigenschaften TLR9-abhängig sind. Die Generierung eines mitogenen pDNA-Vektors (pdeltaS) liefert � im Rahmen der Entwicklung eines HIV-Impfstoffes der Arbeitsgruppe � die Grundlage für das Design eines HIV-Impfstoffes der zweiten Generation.udDer Einsatz von pDNA-basierten Vektoren in der Gentherapie setzt eine hohe Expression des eingebrachten Transgens voraus. Im zweiten Teil der Arbeit wurde daher am Beispiel von murinem Erythropoietin (mEPO) der Einfluss des Gehaltes an intragenischen CpG-Sequenzen sowie von Kodonvariationen auf die in vitro und in vivo Expression eines Transgens evaluiert. Die Eliminierung aller intragenen CpGs resultierte in einer verminderten in vitro Expression, die Kodon-Optimierung sowie die Erhöhung des CpG-Gehaltes hingegen in einer Expressionssteigerung. Das unterschiedliche Expressionsmuster der mEPO-Genvarianten war bereits auf mRNA-Ebene ausgeprägt und ist kein Resultat unterschiedlicher Translationseffizienzen. In vivo konnte in Balb/c Mäusen im Falle Kodon-optimierter und CpG-modifizierter Gene über einen Zeitraum von über einem Jahr eine stark erhöhte mEPO-Expression gezeigt werden. Nach in vivo Elektroporation der modifizierten mEPO-Gene war zudem bereits bei niedrigen pDNA-Dosen eine dauerhafte und signifikante Erhöhung der von mEPO regulierten Hämatokrit- und Hämoglobin-Werte nachweisbar, ohne dass dabei Nebenwirkungen beobachtet werden konnten. udDie Daten zeigen, dass durch CpG-Sequenzmodifizierungen im pDNA-Vektorrückgrat gezielt Einfluss auf die Induktion des angeborenen Immunsystems genommen werden kann. Zudem haben, wie am Beispiel von mEPO gezeigt, die Erhöhung des intragenischen CpG-Gehaltes sowie Kodon-Optimierungen eine stark erhöhte Expression und somit auch Wirksamkeit eines therapeutisch eingesetzten Gens zur Folge.