Robust microbial construction and efficient processes for recombinant enzymes production in Escherichia coli

摘要

Encara que els gens de resistència a antibiòtics són una eina important per a la selecció i manteniment de plàsmids recombinants, les autoritats reguladores consideren el seu ús inacceptable en diverses àrees dins la indústria biotecnològica, sobretot quan el producte serà utilitzat amb finalitat terapèutica. Un sistema d'expressió basat en el vector pQE (Quiagen) amb un marcador de selecció plasmídic alternatiu (basat en l'auxotròfia de glicina) va ser desenvolupat prèviament (Vidal et al., 2008). El sistema d'expressió pQE es basa en el promotor T5, induïble per IPTG. La no-­‐ estabilitat del promotor en absència d'inductor pot provocar una inestabilitat estructural del vector, que portarà a nivells baixos d'expressió deguts, per exemple, a fenòmens de recombinació a la regió del promotor T5. El repressor lac, codificat pel gen lacI, s'uneix molt fortament al promotor, interferint en la transcripció del gen d'interès. Així doncs, els nivells transcripcionals del gen lacI tenen un paper crític en els sistemes d'expressió basats en el promotor T5, influenciant els nivells basals de transcripció i la concentració d'inductor. Encara que la sobreexpressió de la proteïna d'interès és un factor important en quant a càrrega metabòlica, també cal tenir en compte la contribució deguda a l'expressió d'altres gens plasmídics. En aquest sentit, per tal de millorar la robustesa del sistema i minimitzar la càrrega metabòlica relacionada amb els gens codificats als plàsmids, s'han eliminat tots els gens de resistència a antibiòtics i s'han afinat els nivells d'expressió del marcador auxotròfic (glyA) i del repressor lac (lacI). En aquest treball s'han construït uns cassettes d'expressió on els gens lacI i glyA estan sota el control d'un seguit de promotors constituents sintètics, per tal d'obtenir suficient inhibidor lacI per evitar la "no-­‐estabilitat del promotor" i assegurar el nivell mínim de transcripció de glyA necessaris tant per al manteniment del plàsmid com per al correcte creixement del cultiu en medi definit. A més, el gen de resistència a antibiòtic en el vector d'expressió va ser reemplaçat per la construcció glyA-­‐lacI, obtenint un sistema totalment lliure de gens per a la resistència a antibiòtic. Finalment, s'ha estudiat la capacitat per a la sobreexpressió de FucA recombinant a diferents escales (flascons agitats i bioreactor) i en diversos modes d'operació (discontinu i discontinu alimentat) per tal d'obtenir alts nivells d'expressió. Per últim, per tal d'analitzar la població bacteriana a nivell de cèl·∙lules individuals, els canvis morfològics (FSC i SSC) i les característiques físiques i bioquímiques de les diferents cèl·∙lules dins la població bacteriana, s'han realitzat anàlisis de citometria de flux