Biochemical, biophysical and structural characterization of Lactococcus lactis bacteriophage proteins involved in Homologous Recombination and Abortive Infection mechanisms

摘要

I batteriofagi virulenti del gruppo 936 e P335 sono predominanti nelle infezioni verso Lactococcus lactis, un batterio Gram-positivo molto diffuso nell’industria casearia. Tra i meccanismi adottati dal batterio contro l’infezione virale, ritroviamo i meccanismi abortivi antivirali (Abi), di cui poco si conosce riguardo alla loro modalità d’azione. Sotto la pressione selettiva dei sistemi Abi, la ricombinazione omologa con sequenze presenti nel cromosoma batterico (Bouchard et al 2000 et 2002, Moineau et al 1995) produce fagi mutati che sono stati ritrovati in fermentazioni ad esito negativo e perciò recanti enormi perdite economiche. Riguardo il sistema AbiK, Bouchard et al (Bouchard et al 2004) hanno identificato quattro proteine denominate Sak, a bassa similarità di sequenza, ma tutte implicate nella sensibilità verso AbiK. Tra queste proteine, Ploquin et al (Ploquin et al 2008) hanno dimostrato che la ORF252 del fago ul36 (specie P335), denominata Sak, é una “DNA Single Strand Annealing Protein (SSAP)“, omologa della proteina eucariotica RAD52. Sak3 del fago p2 (specie 936) é invece la proteina di riferimento del terzo gruppo di geni sak che non mostrano alcuna similarità di sequenza con le SSAPs. Indipendentemente da questo, le proteine Sak sono sicuramente coinvolte nel meccanismo di ricombinazione omologa poiché i loro geni sono localizzati in « recombination cassette » insieme a geni di altre proteine chiaramente implicate in questi meccanismi (Bouchard and Moineau, 2004). La prima parte dei nostri studi é stata focalizzata sulla caratterizzazione biochimica e strutturale delle due proteine Sak : Sak del fago UL36 e Sak3 del fago p2. Di queste ultime abbiamo studiato lo stato di oligomerizzazione attraverso un approccio multi-tecnica, abbiamo visualizzato le tipiche strutture ad anello (Cryo Microscopie Electronique) ed allestito test funzionali per chiarire la loro appartenenza alla famiglia delle SSAP. La loro capacità di legare il DNA é stata inoltre testata e studiata attraverso « Electrophoretic Mobility Shift Assays, EMSA », Microscopia a Forza Atomica (AFM) e « Surface Plasmon Resonance, SPR » ; la relazione con altri partners nel processo di ricombinazione omologa é stata inoltre testata tramite SPR. Nella seconda parte del nostro studio, abbiamo caratterizzato la “Single-Strand Binding protein (SSB)” del fago p2, partner di Sak3 nella ricombinazione omologa. A questo proposito sono stati studiati il livello di espressione di SSB durante l’infezione fagica, la sua capacità di legare il DNA a singolo filamento, le sue implicazioni nel meccanismo di ricombinazione omologa ed abbiamo determinato la sua struttura tridimensionale. I nostri risultati costituiscono gli elementi che permetteranno la comprensione di alcune funzioni sconosciute delle proteine Sak, in particolare del legame tra gli avvenimenti del processamento del DNA ed il sistema AbiK, dell’implicazione di altre proteine correlate come le SSBs in questi meccanismi.