Expresión heteróloga de la proteína mayor de la cápsida (L1) del virus del papiloma humano tipo 18: purificación y caracterización de las proteínas recombinantes y partículas similares al virus (VLPS)

摘要

La infección con el virus del papiloma humano (VPH) es la ETS más común en mujeres. Un tercio de los VPH mucosotrópicos, denominados de alto riesgo, están relacionados con el cáncer de cérvix, siendo el tipo 18 el segundo más. El 60% de las mujeres infectadas sufrirán seroconversión con anticuerpos neutralizantes dirigidos a epítopos conformacionales de la proteína mayoritaria de la cápsida (L1). Si bien los títulos de anticuerpos tras la infección natural son bajos, los adquiridos tras la vacunación son 40 a 100 veces superiores. La producción de antígenos de VPH es necesaria para estudiar la respuesta humoral frente a la infección natural así como en población vacunada, dado que se desconoce la duración de la protección conferida por la vacunación. El objetivo del trabajo fue la producción la proteína L1 de VPH18 como proteína recombinante en Escherichia coli, en un sistema basado en la levadura metilotrófica Pichia pastoris y en células de insecto empleando baculovirus recombinantes. En E. coli la expresión se realizó como proteínas de fusión con GST observándose la formación de cuerpos de inclusión. El tratamiento con lisozima, agentes reductores y detergentes durante la lisis y/o solubilización de la fracción insoluble, incrementó su recuperación. La purificación cromatográfica combinada con elución en PBS/urea, permitió eliminar proteínas bacterianas coprecipitantes. La proteína GST-ΔN7118L1 fue reconocida en Westernblot y ELISA por sueros comerciales y humanos de infección natural. En P. pastoris se detectó transcripción específica de las proteínas a niveles basales no inducibles por metanol, pero no traducción, planteándose la existencia de problemas relacionados con terminación prematura de la transcripción. Finalmente se purificaron VLPs de VPH18 en células de insecto empleando baculovirus recombinantes, previo estudio de la cinética de expresión de la proteína en este sistema, que pusieron de manifiesto los parámetros óptimos para la producción y purificación de VLPs.