Différenciation génomique des coronavirus hémagglutinants et topographie des déterminants antigéniques de la glycoprotéine S du virus hémagglutinant de l’encéphalomyélite porcin.

摘要

Le virus hémagglutinant de 1'encéphalomyélite porcine (HEV) est un virus qui cause une infection endémique dans l'industrie porcine. En 1998 et 1999, le HEV a causé des problèmes dans des fermes porcines du Québec et de l'Ontario. Une souche virale a été isolée et nous avons cherché à comprendre les raisons de la réémergence de la maladie en étudiant les différences entre cette souche (IAF-404) et celle du prototype de référence (HEV67N), de même que les différences et/ou les similitudes entre les souches de HEV et celles d'autres coronavirus dont le Coronavirus bovin et le Coronavirus humain HCoV­ OC43, tous deux antigéniquement associés au HEV.udududCe projet visait le séquençage de l'ORF 3 codant pour la glycoprotéine de surface (S) du HEV et la production d'anticorps monoclonaux (AcMo) dirigés contre cette protéine afin d'obtenir les outils nécessaires à une meilleure compréhension d'un virus peu étudié. Le second aspect de ce projet était de mettre au point un test diagnostic différentiel pour les Coronavirus bovins, porcins et humains.ududLe séquençage de l'ORF 3 s'insérait dans le projet du séquençage de l'extrémitéudud3' du génome, codant pour les protéines structurales, des souches HEV 67N et IAF-404. La séquence nucléotidique de l'ADNe de l'ORF3 fut déterminée par la technique de déplacement progressif sur le génome en utilisant des amorces oligonucléotidiques déduites de régions conservées chez les isolats de BCoV. Les séquences de la souche de référence HEV67N et celles d'un isolat clinique HEV IAF-404 ont été comparées aux séquences connues des virus BCoV et de HCoV-OC43. Le séquençage a mis en lumière, entre autres, que la glycoprotéine S a le plus faible pourcentage de similitude entre les souches de HEV, mais aussi avec les autres Coronavirus à l'étude et a confirmé que tout comme pour le HCoV-OC43, il y avait délétion d'une partie de l'ORF 4, codant chez les isolats de BCoV pour une protéine non-structurale de 4.9 kDa.udududLes informations obtenues du séquençage ont permis la conception d'un MultiplexududRT-PCR composé de trois paires d'amorces différentes. Une paire d'amorces vise l'amplification spécifique d'un fragment de 200 pb dans I'ORF 4 des BCoV respiratoires et entériques. Une autre, permet l'amplification d'un fragment de 684 pb, dans la portion SI de l'ORF 3, spécifique aux isolats de HEV. Ces deux paires d'amorces s'ajoutent à l'utilisation déjà connue d'une paire d'amorces pour l'amplification d'un fragment de 406 pb dans le gène de la Nucléocapside. Ce gène est hautement conservé chez les Coronavirus à l'étude et pennet donc une amplification dite spécifique de groupe.udududFinalement, des hybridomes producteurs d'AcMo dirigés contre la glycoprotéineS ont été obtenus. Des tests d'isotypage, d'ELISA, d'immunobuvardage de type western, d'immunofluorescence indirecte, d'inhibition de l'hémagglutination et de séroneutralisation ont été effectués pour pennettre la caractérisation de ces AcMo.udududLes informations scientifiques apportées par ce projet sont intéressantes et constituent une base pour des études plus approfondies en utilisant le multiplex RT-PCR et les AcMo comme outils afin d'établir la topographie des épitopes spécifiques au HEV et des régions de la protéine impliquées dans le tropisme d'espèce et les recombinaisonsudgénétiques inter-espèces.