Pharmacological manipulation of dendritic cells in vitro and in vivo

摘要

Dendritische Zellen gehören zum angeborenen Immunsystem und präsentieren professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die immunologische Antworten initiieren und anregen. In den bestimmten Fällen wie einer Transplantation ist es erwünscht, dass die körpereigene Abwehr selektiv reduziert wird, so dass der Körper das körperfremde Organ nicht abstößt, jedoch gleichzeitig eine ausreichende Immunität gegen Bakterien, Viren und Krebs erhalten bleibt.Ein therapeutischer Ansatz wäre die selektive Hemmung dendritischer Zellen. Sie spielen eine zentrale Rolle im Immmunsystem und präsentieren interessante Ziele für die pharmakologische Manipulation. Eine Hemmung dendritischer Zellen führt zu einer verringerten endozytotischen Antigenaufnahme, -präsentation und Produktion proinflammatorischer Zytokine und könnte folglich die chronsiche Organabstoßung verzögern oder verhindern. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob man Sanglifehrin A (SFA), eine neue immunophilin bindende Substanz, zur pharmakologischen Programmierung tolerogener Dendritischer Zellen nutzen kann, um einen Effekt in Alloimmunitätsmodellen und Organtransplantationsmodellen zu zeigen. Die pharmakologischen Effekte von SFA auf dendritische Zellen wurden in vitro und in vivo untersucht. In ersten Versuchen zeigten wir, dass SFA keinen Effekt auf Differenzierung oder phänotypische Reifung von Dendriten hat. Als nächstes untersuchten wir eine Reihe von Zytokinen, unter anderem IL-12p70, das eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von Entzündungen und Autoimmunerkrankungen spielt. Wir fanden heraus, das SFA die Produktion von bioaktivem IL-12p70 in dendritschen Zellen reduziert, die Hauptquelle für bioaktives IL-12. Im direkten Vergleich zu dem verwandten Calcineurin-Inhibitor Cyclosporin A und dem „mammalian Target of Rapamycin“ (mToR) Hemmer Rapamycin, hemmt nur SFA schon innerhalb einer Stunde 80–95 % der IL-12p70 Produktion von differenzierten Dendriten. Um zu zeigen, das es sich um einen stimulusunabhängigen Mechanismus handelt, wurden die Versuche sowohl mit Toll-like Rezepor 3 als auch 4 Liganden durchgeführt. Es wurden Rezeptorverdrängungsexperimente durchgeführt, bei denen molare Überschüsse von Cyclosporin A vor der Zugabe von SFA zur Zellkultur gegeben wurden. Die Ergebnisse zeigen eine äqipotente Hemmung der IL-12p70 Produktion mit oder ohne Cyclopsorin A: Daraus lässt sich eine Cyclophilin- unabhängige Blockade der IL-12p70 Produktion durch SFA vermuten.Die starke Hemmung der IL-12p70 Produktion wurde in einer Versuchsreihe mit gereinigten peripheren Blut-Dendriten bestätigt. Echtzeit-PCRs ergaben eine 84-95% Hemmung der IL-12p40-, IL-12p35- und der IL-23-spezifischen p19 Transkription.In einem nächsten Schritt sollte untersucht werden, ob diese in vitro Ergebnisse im in vivo Mausmodell reproduzierbar sind, um die klinische Relevanz dieser Ergebnisse zu klären. Die in vivo Untersuchungen zeigten, das dreitägige Injektionen von SFA in Mäuse (Kontrolltiere erhielten eine wirkstofffreie Trägerlösungen injiziert) und die darauffolgende in vivo Stimulation mit LPS/IL-4 70% der Produktion von bioaktivem IL-12 hemmten. Mit weiteren unabhängigen Modellen zeigten wir, das SFA mehr als 90% der IL-12p70 Produktion hemmt, während es keinen Effekt auf IL-10 und TNF-α hat. Die in vivo Behandlung mit SFA zeigte keine Einfluß auf die in vivo Expansion oder die phänotypische Reifung von DC Subtypen und hatte keinen Effekt auf die DC Population.Außerdem hemmte SFA die rezeptorvermittelte Endozytose und Makropinozytose und die indirekte Antigenpräsentation von CD11c+ dendritschen Zellen in vivo. Unsere Ergebnisse zeigten zum ersten Mal den Effekt von Sanglifehrin A in vivo. Die Ergebnisse lassen vermuten, insbesondere die Bestätigung durch die in vivo Experimente, das es sich bei Sanglifehrin A um eine Subanz mit einem einzigartigen Wirkprofil gegenüber dendritschen Zellen handelt: starke Hemmung sowohl der Antigen-Aufnahme als als auch der IL-12p70 Produktion, aber keinen signifikanten Einfluß auf Differenzierung, Expansion oder Expression von Oberflächenmarkern dendritischer Zellen. Unserem Wissen nach gab es bisher keine immunosuppressive Substanz, die zwei Schlüsselfunktionen, IL-12 Produktion und Antigenaufnahme hemmt, aber keine Effekte auf Differenzierung oder Expansion hat.Wir vermuten, das SFA eine neue Klasse immunophilinbindender Immunsuppressiva darstellt, die eine hohe Aktivität auf dendritische Zellen zeigt und in der Kombination mit anderen Immunsuppressiva synergistische Wirkungen entfaltet. Somit könnte die Kombination von immunsuppressiven Substanzen mit Sanglifehrin A ein wirkungsvoller Ansatz sein, um chronische Tranplantatabstoßung zu verhindern.