Beeinflussung der Funktion des pro-inflammatorischen Cytokins Makrophagen Migrations-Inhibitions Faktor durch das ribosomale Protein S19

摘要

Der Makrophagen Migrations Inhibitions Faktor (MIF) ist ein pleiotroper Immunmodulator, der unter verschiedenen inflammatorischen Bedingungen, wie Infektionen, Sepsis und Autoimmunerkrankungen eine kritische Rolle übernimmt. MIF bindet an eine Reihe von Molekülen wobei sich die Funktionen von MIF und Interaktor gegenseitig beeinflussen können. Die genauen molekularen Mechanismen blieben dabei bis heute oftmals ungeklärt.Zum besseren Verständnis der biologischen Rolle von MIF wurde nach weiteren intrazellulären Interaktionspartnern von MIF gesucht und so die Bindung von MIF an das ribosomale Protein RP S19 gefunden (Filip 2009). Für viele ribosomale Proteine, wie auch Translations- und Elongationsfaktoren, wurden extraribosomale Funktionen also Funktionen außerhalb der Proteinbiosynthese nachgewiesen. Deshalb sollte untersucht werden in welchem Maße die Bindung von RP S19 an MIF dessen biologische Funktionen, wie die Aufhebung der antiinflammatorischen Wirkung von Glucocoticoiden - glucocorticoid overriding Effekt genannt - oder die chemotaktische Wirkung auf Makrophagen und Monozyten beeinflusst. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, dass der glucocorticoid overriding Effekt von MIF, auf mit LPS stimulierten Monozyten, durch Zugabe von RP S19 teilweise wieder aufgehoben werden kann. Damit fungiert RP S19 extraribosomal als ein endogener Inhibitor der proinflammatorischen Aktivität von MIF. Da die chemotaktische Wirkung von MIF auf aus humanem Blut isolierten Monozyten nur schwach und nicht signifikant erhöht zur Negativkontrolle ausfiel, ließ sich hier keine Aussage über den Einfluß von RP S19 treffen.Einige ribosomale Proteine werden mit dem Ubiqitin-ähnlichen Protein NEDD8 konjugiert, was zu einer erhöhten Stabilität dieser Proteine führt. Deshalb sollte in dieser Arbeit überprüft werden, ob RP S19 ebenfalls mit NEDD8 konjugiert vorliegt. Nachfolgend sollte ggf. überprüft werden, ob die Konjugation Einfluss auf die Stabilität von RP S19 und damit auch auf die Wirkung von RP S19 auf MIF hat. Im Gegensatz zu RP L11 als positiver Kontrolle konnte jedoch keine Konjugation von NEDD8 an RP S19 in kultivierten Zellen nachgewiesen werden NEDD8 scheint somit keinen Einfluss auf die ribosomalen oder extraribosomalen Funktionen von RP S19 zu haben.Durch den Einsatz von RP S19 Punkt- und Verkürzungsmutanten sollte der für die Bindung an MIF essentielle Bereich im RP S19 Molekül charakterisiert werden, um ein besseres Verständnis des molekularen Zusammenspiels beider Moleküle zu erhalten. Zwei missense Mutanten (RP S19-W52R und R62W) wurden im Vergleich zum Wildtyp in der Koimmunopräzipitation mit Anti MIF Antikörpern signifikant weniger mitgefällt, wogegen die Ergebnisse für die Mutante R101H stark variierten. Die beiden für die missense Mutationen verantwortlichen Punktmutationen liegen im so genannten Hotspot, einer Genregion zwischen den für die Aminosäuren 52 bis 62 kodierenden Nukleotiden im RP S19 Gen. In dieser Region liegen viele Mutationen, die bei Patienten mit Diamond-Blackfan-Anämie gefunden wurden. Offensichtlich ist diese Region auch für die Bindung von RP S19 an MIF wichtig. Weitere Koimmunpräzipitationsexperimente mit N- und C-terminalenVerkürzungsmutanten lassen den Schluss zu, dass die Region zwischen den Aminosäuren K41 und V103 für die Interaktion mit MIF notwendig ist. Diese schließt auch den Hotspot mit ein.MIF ist in geringen Mengen in der Zirkulation nachweisbar. Auch für RP S19 wurde dies kürzlich im Western Blot gezeigt, sodass eine biologisch relevante Interaktion im Blut oder auch anderen Körperflüssigkeiten realistisch erscheint. In dieser Arbeit gelang es jedoch nicht, den publizierten RP S19 Nachweis zu wiederholen. Zwar verbesserte die Entfernung der Immunglobuline aus humanem Serum den Hintergrund, auf der anderen Seite wurde durch Zusatz von rekombinantem Protein deutlich, dass die beschriebenen Aufreinigungsschritte zu einem massiven Verlust von RP S19 führten und damit den Nachweis erschwerten statt ihn zu ermöglichen.In Zukunft erscheint die Untersuchung der inhibierenden Wirkung von RP S19 auf MIF Funktionen im Tiermodell interessant. Angesichts der Vielzahl an Autoimmunerkrankungen für die MIF mitverantwortlich scheint, könnte RP S19 einen therapeutisch interessanten endogenen Modulator des proinflammatorischen Zytokins MIF darstellen.