Untersuchungen zur Optimierung der Kryokonservierung caniner Spermien unter besonderer Berücksichtigung verschiedener Verdünner

摘要

Untersuchungen zur Optimierung der Kryokonservierung caniner Spermien unter besonderer Berücksichtigung verschiedener Verdünner Die Kryokonservierung von Rüdensperma gewinnt durch den stetig steigenden Einsatz der künstlichen Besamung zunehmend an Bedeutung. Zahlreiche kommerzielle und nicht-kommerzielle Verdünner-Systeme sind bereits beschrieben und verfügbar. Ziel dieser Studie war es, drei verschiedene Verdünner, zwei selbst hergestellte Tris-Eidotter-Verdünner (TE und Uppsala Equex System 2, Up, nach Linde-Forsberg, 2001) sowie den kommerziellen CaniPRO™ Freeze A&B Verdünner (CP), bezüglich ihrer Eignung für die Kryokonservierung von caninem Sperma sowie für den Einsatz im täglichen Kliniks-Alltag zu untersuchen. Des Weiteren wurde der Zusatz eines Auftaumediums (UpA, Auftaumedium des Uppsala Equex Systems 2 nach Linde-Forsberg, 2001) zur Verbesserung der Spermaqualität untersucht. Mittels digitaler Manipulation wurden 30 Ejakulate fraktioniert von zehn gesunden Rüden verschiedener, großer Rassen sowie 3 Ejakulate von einem Rüden (Sonderfall) mit benigner Prostatahyperplasie, Prostatazysten und chronischer Prostatitis gewonnen. Unmittelbar an die Gewinnung wurde die spermienreiche Fraktion makroskopisch (Volumen, Farbe, Geruch, Konsistenz, Beimengungen), chemisch-physikalisch (pH-Wert) und mikroskopisch untersucht. Die mikroskopische Untersuchung schloss eine Dichtebestimmung mittels SpermaCue® zur Berechnung der Gesamtspermienzahl und eine subjektive Beurteilung von Gesamt- (GM) und Progressivmotilität (PM), Lebend-Tot-Anteil, Anteil morphologisch veränderter Spermien (Eosin-Ausstrich), akrosomalem Status (Spermac®-Färbung) und Membranintegrität (HOS-Test) ein. Ergänzend wurde eine computerassistierte (CASA) Motilitäts- (GMCASA, PMCASA) und Viabilitätsanalyse (SYBR14/PI) mittels SpermVision® (Minitüb) durchgeführt. Die spermienreiche Fraktion wurde in drei Aliquots aufgeteilt und mit einem der drei Verdünner (TE, UP, CP) aufgearbeitet und nach entsprechender Equilibrierung bei 4°C in Midipailletten eingefroren. Unmittelbar vor dem Einfrieren erfolgte eine erneute Untersuchung eines Aliquots, um die Unterschiede zwischen Nativsperma und vollständig aufgearbeitetem Sperma vor Kryokonservierung festzuhalten. Weitere Untersuchungen wurden direkt nach dem Auftauen (60 Sekunden, 37°C) sowie nach 10, 30 und 60 Minuten durchgeführt. Zudem wurde unmittelbar nach dem Auftauen ein Aliquot 1:1 mit Auftaumedium versetzt und ebenso untersucht. Im Nativsperma wurden folgende Befunde erhoben: Gesamtspermienzahl 894,8 ± 150,3 Mio., PM 80,0 ± 4,8 %, GMCASA 78,2 ± 7,9 %, PMCASA 70,6 % (+ 8,0;- 8,7); Lebend-Tot-Anteil 87,7 ± 2,8 %, Viabilität 85,9 ± 5,7 %, morphologisch veränderte Spermien 11,7 ± 4,6 %, Kappenverluste 0,1 % (+ 0,3; 0), nicht aufgerollte Geißel im HOST 4,7 ± 0,1 %.Nach vollständiger Aufarbeitung, jedoch vor Kryokonservierung war in mit CP-aufgearbeiteten Proben die geringste Beeinflussung der Motilitätsparameter, in mit TE-aufgearbeiteten Proben die größte Beeinflussung nachweisbar. Nach der Kryokonservierung war die Motilität in Up-Proben am höchsten (GM 60,5 ± 7,0 %, PM 50,5 ± 13,4 %, GMCASA 50,1 ± 13,9 %, PMCASA 37,0 % (+ 13,8; - 12,8)) verglichen mit CP-verdünnten Ejakulaten (GM 49,8 ± 12,6 %, PM 41,7 ± 15,2 %, GMCASA 28,9 ± 10 %