Experimentelle Untersuchungen zum pulmonalen Hochdruck : die Bedeutung der Hypoxie-induzierbaren Faktoren für pulmonalvaskuläre Remodellingprozesse in pulmonalarteriellen Fibroblasten

摘要

Die Hypoxie induzierte Proliferation der pulmonalarteriellen Fibroblasten in der Adventitia der kleinen intrapulmonalen Arterien ist als frühes Stadium in der Entwicklung der pulmonalen Hypertonie und des Cor pulmonale beschrieben worden. Wir untersuchten die Rolle der Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF-1alpha und HIF-2alpha) in primären humanen pulmonalarteriellen Fibroblasten (FB-PA) unter hypoxischen Bedingungen. Der Schwerpunkt lag in der Differenzierung zwischen den beiden HIF-Isoformen und die Bedeutung der Inhibition für die pathophysiologische Reaktion der PA-FB unter Hypoxie. Dazu wurde zunächst die RNA interferenz zur Inhibition von HIF an den humanen Adenokarzinomzellen (A549) etabliert. Es zeigte sich eine potente Inhibition von HIF-1alpha, die Auswirkungen auf die Zellzyklusregulation unter Hypoxie hatte. Vor der Anwendung dieser Methode an den primären Zellen wurden zunächst die Reaktion der PA-FB auf Hypoxie und die Expression der Hypoxie-induzierbaren Faktoren untersucht. Unter hypoxischen Bedingungen reagierten die PA-FB mit einer starken proliferativen Antwort. Im Zellzyklus bewirkte die Hypoxie eine Verschiebung der PA-FB in die S-Phase, wobei die Apoptose gleichzeitig supprimiert wurde. Neben der Steigerung der Proliferation induzierte Hypoxie auch die Migration der PA-FB. Die Expression von alpha-Smooth-Muscle-Cell Aktin, als Indikator der Transdifferenzierung zu Myofibroblasten, blieb jedoch unverändert. Die folgende Analyse der Expression konnte HIF-1alpha und HIF-2alpha auf mRNA-Ebene konstitutiv nachweisen. Auf Protein-Ebene zeigten beide HIF-Isoformen eine starke Induktion unter Hypoxie und unter normoxischen konnte nur das HIF-2alpha Protein zytosolisch und perinukleäre nachgewiesen werden. Die Aktivierung der beiden Subtypen und somit die Funktionalität als Transkriptionsfaktor wurde mittel RT-PCR für die Zielgene von HIF-1alpha und HIF-2alpha dargestellt. Durch siRNA für HIF-1alpha und HIF-2 wurde diese Aktivierung sowohl für die Phosphoglycerat Kinase (PGK), als auch für den Vascular endothelial growth factor (VEGF) inhibiert. Weiterhin bedingte die Suppression von HIF-1alpha, wie auch von HIF-2alpha einen Stopp der Hypoxie induzierten Migration, wobei die Proliferation nur durch siRNA gegen HIF-2alpha zu inhibieren war. PA-FB proliferieren und migrieren unter Hypoxie HIF gesteuert, so dass eine Transdifferenzierung in der Media der pulmonalarteriellen Gefäße ermöglicht wird. Die Proliferation ist dabei abhängig von HIF-2alpha während die Migration durch HIF-1alpha und HIF-2alpha gesteuert wird. Die Transdifferenzierung in PA-FB ist weder direkt durch Hypoxie induziert noch HIF abhängig. Diese Ergebnisse demonstrieren die wichtige Bedeutung der Hypoxie induzierten Faktoren in den PA-FB für die Entwicklung der pulmonalen Hypertonie.