Herstellung, Charakterisierung und Einsatz von monoklonalen Antikörpern gegen ein synthetisches ZP2-Peptid

摘要

Das Zona pellucida 2 (ZP2) Protein ist im Maussystem für die feste, sekundäre Bindung des Spermatozoons an die Zona pellucida der Eizelle von Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein monoklonaler Antikörper (mAk) gegen ein synthetisches ZP2 Peptid hergestellt. Dieser Antikörper wurde eingesetzt, um das ZP2-Protein immunbiochemisch, immunhistologisch und funktionell zu untersuchen. MAk ZP2-20 (Klon 24/4 C), der gegen ein synthetisches Peptid gerichtet ist, das speziesübergreifend (homolog) in ZP2 Proteinen vorkommt, konnte erfolgreich hergestellt werden. Immunhistochemische, immunelektronenmikroskopische und Immunfluoreszenz Untersuchungen zeigten, dass mAk ZP2-20 ZP2 Protein von verschiedenen Spezies detektierte. In Untersuchungen zur Expression der ZP2 kodierenden Gene mittels RT-PCR konnte eine mRNA Expression in murinen Eizellen und Ovargewebe gezeigt werden. In Kumulus-/Granulosazellgemischen konnte keine mRNA Expression nachgewiesen werden. Immunoblots zeigten, dass ZP2-20 mit einem 64 / 65 kDa Polypeptid reagierte, das menschlichen bzw. bovinen ZP2-Proteinen entspricht. Nach Einsatz von mAk ZP2-20 konnte im Kompetitions-Hemizona-Assay eine ZP2-Protein-Domäne identifiziert werden, die für die Spermatozoen-Zona pellucida Bindung von Bedeutung ist: Nach Vorbehandlung der Hemizonae mit monoklonalen ZP2-Peptid-Antikörpern war die Anzahl der gebundenen Spermatozoen deutlich herabgesetzt. Aus diesen Befunden kann geschlossen werden, dass die durch das ZP2-Peptid repräsentierte ZP2-Domäne für die feste Bindung von Samenzellen an die Zona pellucida von Bedeutung ist. Im Rahmen von Fertilitätsstudien in der Maus mit ZP2-20 Peptid als mögliche Vaccine im Vergleich zu Kontrollen, zeigte sich tendenziell eine Hemmung der Fertilität. Eine Beeinträchtigung der strukturellen Integrität des ovarialen Gewebes konnte nicht beobachtet werden. Die Untersuchungen zeigen, dass der monoklonale Antikörper mAk ZP2-20 gegen synthetisches Zona pellucida 2 Peptid als spezifische Marker für Zona pellucida Protein eingesetzt werden kann. Außerdem ist dieser Antikörper für Untersuchungen physiologischer Abläufe der Spermatozoen-Eizell-Interaktion geeignet. Die Bedeutung der Ergebnisse für Diagnostik und Therapie in der Reproduktionsmedizin sowie als Grundlage für innovative Konzepte im Bereich der Entwicklung von Kontrazeptiva wird sich in der Zukunft zeigen.