Einfluss der von Exophiala dermatitidis synthetisierten Pigmente auf das Phagozytoseverhalten humaner neutrophiler Granulozyten : Eine explorative Studie am Durchflusszytometer

摘要

In der vorliegenden explorativen Studie am Durchflusszytometer wurde der Einfluss der von Exophiala dermatitidis synthetisierten Pigmente auf das Phagozytoseverhalten humaner neutrophiler Granulozyten im Vollblutansatz untersucht.Basierend auf den Beobachtungen von Mayser et al. (1998), dass der Hefepilz Malassezia furfur auf einem Minimalagar, dem alleinig Tryptophan als Stickstoffquelle zugesetzt war, unterschiedliche Indolderivate zu bilden vermochte, wurde mittlerweile bei diversen, auch phylogenetisch weit voneinander entfernten Pilzen- wie beispielsweise Exophiala dermatitidis- die Fähigkeit zur Pigmentsynthese beschrieben (Nies 2006; Mayser et al. 2007; Heidrich 2010). Diese Untersuchungen führten zur Aufklärung einiger bis dato noch unbekannter Mechanismen, die im Rahmen der Pathogenese von Infektionen durch derartige Pilze von Bedeutung sein können. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den möglichen Einfluss der von zwei Exophiala dermatitidis-Stämmen gebildeten Tryptophanstoffwechselpigmente auf die Phagozytose zu untersuchen und damit Einblicke in ihre eventuelle pathogenetische Wirkung zu bekommen.Dazu wurden der Wildtyp von Exophiala dermatitidis und seine Melaninmangelmutante Mel-3 zur Pigmentinduktion auf 1b-Agar verbracht. Nach der vierwöchigen Inkubation wurden die Pigmente in Form von Rohextrakt aus dem Agar gelöst. Anschließend erfolgte deren Aufreinigung via Säulen- und Dünnschichtchromatographie. Das von Schnitzler et al. bereits 1999 eruierte Protokoll zur Phagozytoseuntersuchung im Vollblutansatz wurde stark modifiziert, um den Fragestellungen dieser Studie gerecht zu werden. So wurden die Granulozyten zusätzlich mit einem CD16+-APC-Antikörper markiert, um sie bei den Messungen im Durchflusszytometer detektieren zu können. Eine Hemmung der Phagozytoseleistung der Granulozyten durch die protektive Wirkung des in der Zellwand des Wildtyps eingelagerten Melanins konnte im Vergleich zu seiner Mutante Mel-3 in einem Vorversuch festgestellt werden.Es konnte gezeigt werden, dass der Einsatz von DMSO als Lösungsvermittler für den Rohextrakt bereits per se eine inhibitorische Wirkung auf die Phagozytose entfaltet. Weiterführende Messserien mit gepoolten, in Methanol gelösten Sephadex-Fraktionen beider Stämme ergaben, dass die des Wildtyps nicht zu einer signifikanten Hemmung der Phagozytose führen. Bei der Melaninmangelmutante Mel-3 zeigten die gepoolten Fraktionen 1 bis 3 bereits nach 10-minütiger Inkubationszeit eine signifikante Hemmung der Phagozytose. Nach Vereinzelung der drei Fraktionen konnte Fraktion 2 für diese Hemmung verantwortlich gemacht werden. Mittels Dünnschichtchromatographie der Fraktion 2 wurde eine Aufteilung infünf Banden vorgenommen. In diesem Bereich liegen keine bisher bekannten Tryptophanpigmente, die Fraktion 2 war jedoch bereits in vorgeschalteten Untersuchungen zum Oxidative Burst hemmend in Erscheinung getreten (Heidrich 2010). Die signifikante Hemmung der Phagozytose konnte durch die Banden 2, 4 und 5 verzeichnet werden. Die zusätzlich in diesem System untersuchte Reinsubstanz Pityriazol aus Malassezia furfur besaß zu keinem untersuchten Zeitpunkt einen signifikanten Einfluss auf die Phagozytose von Exophiala dermatitidis-Mel-3 durch neutrophile Granulozyten.Das gepoolte Pigmentgemisch der Sephadex-Fraktionen 4–10 trat in Bezug auf die Phagozytose nicht als signifikant hemmend in Erscheinung. Das darin enthaltene „Anthrazit“ (in Fraktion 6) besitzt demnach nur hinsichtlich des oxidativen Burst Relevanz (Heidrich 2010). Seine strukturelle Aufklärung gelang aufgrund einer nach wie vor zu geringen Ausbeute nicht.Insgesamt wiesen beide Stämme von Exophiala dermatitidis ein zuverlässig reproduzierbares, großes Spektrum an Tryptophanpigmenten auf, die in Form von aufgereinigten Säulenchromatographie-Fraktionen und Einzelbanden eine Hemmung der Phagozytose induzierten. Sie spielen somit möglicherweise eine bedeutende Rolle als Pathogenitätsfaktoren im Rahmen von Exophiala dermatitidis-Infektionen bei Mensch und Tier.