Développement des marqueurs moléculaires spécifiques pour l'identification et la quantification de deux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires en utilisant la PCR en temps réel

摘要

Les champignons mycorhizien à arbuscules (CMA) sont des organismes pouvantétablir des symbioses avec 80% des plantes terrestres. Les avantages d'une telle symbiosesont de plus en plus caractérisés et exploités en agriculture. Par contre, jusqu'àmaintenant, il n'existe aucun outil permettant à la fois l'identification et la quantificationde ces champignons dans le sol de façon fiable et rapide. Un tel outil permettrait, entreautres, de mieux comprendre les dynamiques des populations des endomycorhizes dans lesol. Pour les producteurs d'inoculum mycorhiziens, cela permettrait également d'établirun suivi de leurs produits en champs et d'avoir un contrôle de qualité de plus sur leursinoculants. C'est ce que nous avons tenté de développer au sein du laboratoire du Dr.Hijri. Depuis environ une trentaine d'années, des outils d'identification et/ou dequantification ont été développés en utilisant les profiles d'acides gras, les isozymes, lesanticorps et finalement l'ADN nucléaire.À ce jour, ces méthodes d’identification et de quantification sont soit coûteuses,soit imprécises. Qui plus est, aucune méthode ne permet à la fois la quantification etl’identification de souches particulières de CMA.L’ADN mitochondrial ne présente pas le même polymorphisme de séquence quecelui qui rend l’ADN nucléaire impropre à la quantification. C'est pourquoi nous avonsanalysé les séquences d’ADN mitochondrial et sélectionné les régions caractéristiques dedeux espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA). C’est à partir de cesrégions que nous avons développé des marqueurs moléculaires sous forme de sondes etd’amorces TaqMan permettant de quantifier le nombre de mitochondries de chacune deces espèces dans un échantillon d’ADN. Nous avons ensuite tenté de déterminer uneunité de quantification des CMA, soit un nombre de mitochondries par spore. C’est alorsque nous avons réalisé que la méthode de préparation des échantillons de spores ainsi quela méthode d’extraction d’ADN avaient des effets significatifs sur l’unité dequantification de base. Nous avons donc optimisé ces protocoles, avant d’en e testerl’application sur des échantillons de sol et de racines ayant été inoculés avec chacune desdeux espèces cibles. À ce stade, cet outil est toujours semi-quantificatif, mais il permet9l’identification précise de deux espèces de CMA compétentes dans des milieux saturés enphosphore inorganique. Ces résultats , en plus d’être prometteurs, ont permisd’augmenter les connaissances méthodologiques reliées à la quantification des CMA dansle sol, et suggèrent qu’à cause de leurs morphologies différentes, l’élaboration d’unprotocole de quantification standardisé pour toutes les espèces de CMA demeure unobjectif complexe, qui demande de nouvelles études in vivo.