Étude du polymorphisme intra- et inter-spécifique du gène β-tubuline chez desespèces de champignons mycorhiziens à arbuscules en vue de développer desmarqueurs moléculaires

摘要

Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA), classés dans le phylum Glomeromycota, ne peuvent pas être facilement identifiés par la morphologie de leurs spores et leurs mycélia à l'intérieur ou à l'extérieur des racines de leurs hôtes. Ce problème fondamental d'identification rend l'étude de leur diversité, en particulier dans leur habitat naturel (sol et racine) extrêmement difficile.Les gènes ribosomaux ont été largement utilisés pour développer des amorces spécifiques et en inférer des arbres phylogénétiques. Cependant, ces gènes sont très polymorphes etexistent en plusieurs copies dans le génome des CMA, ce qui complique l’interprétation des résultats.Dans notre étude, nous avons étudié le polymorphisme intra- et inter-spécifique du gène β-tubuline, présent en faible nombre de copies dans le génome des CMA, afin d’obtenir denouvelles séquences nucléotidiques pour développer des marqueurs moléculaires. Lesgènes β-tubuline amplifiés à partir de l'ADN génomique de cinq espèces du genre Glomusont été clonés et séquencés. L’analyse des séquences indique un polymorphisme intraspécifique chez trois espèces de CMA. Deux séquences paralogues très variables ont été nouvellement identifiées chez les G. aggregatum, G. fasciculatum et G. cerebriforme.Aucun polymorphisme n’a été détecté chez les G. clarum et G. etunicatum. Toutes lesséquences montrent la présence de deux introns hautement variables. La majorité dessubstitutions ont été localisées dans les exons et sont synonymes à 90%. La conservation des acides aminés suggère un niveau élevé de sélection négative sur le gène β-tubuline etnous permet de confirmer que les CMA représentent un ancien groupe fongique (400million d’années). L’analyse phylogénétique, réalisée avec vingt et une séquencesnucléotidiques du gène β-tubuline, a révélé que les séquences des Glomaceae forment ungroupe monophylétique bien supporté, avec les Acaulosporaceae et Gigasporaceae commegroupe frère. Les séquences paralogues nouvellement identifiées chez les G. aggregatum et G. fasciculatum n'ont pas été monophylétiques au sein de chaque espèce. Lesoligonucléotides ont été choisis sur la base des régions variables et conservées du gène β-tubuline. Le test PCR des amorces β-Tub.cerb.F/ β-Tub.cerb.R a révélé des bandesspécifiques de 401 pb pour les séquences paralogues du G. cerebriforme. Deux pairesd’amorces ont été développées afin d’identifier les séquences du groupe nommé Tub.1. Les tests PCR nous ont permis d’identifier certaines séquences du groupe Tub.1. Une paire d’amorce β-Tub.2.F/ β-Tub.2.R nous a permis d’identifier certaines séquences paralogues du groupe nommé Tub.2.L’analyse d’autres gènes combinée à celle du gène β-tubuline permettra le développementde marqueurs moléculaires plus spécifiques pour l’identification de CMA.