Photolyase/Cryptochrom-Homologe aus Synechocystis sp. PCC 6803 und Arabidopsis thaliana: Funktion, Lokalisation und biochemische Eigenschaften

摘要

In dieser Arbeit wurden Photolyase/Cryptochrom-homologe Proteine (cry und phr) aus dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 und ein neues Cryptochrom (At-cry3) aus der Hoeheren Pflanze Arabidopsis thaliana charakterisiert. Synechocystis CRY liegt mit den offenen Leserastern sll1628 und sll1630 in einem Operon. Die durch sll1628 kodierte Aminosaeuresequenz besitzt eine schwache Homologie zu einem TPR (tetratricopeptide repeat)-Domaenen Protein; die sll1630 Aminosaeuresequenz ist zu keinem bekannten Protein homolog. Für das in E. coli heterolog exprimierte Synechocystis cry konnte nachgewiesen werden, dass es nicht kovalent FAD bindet. Die phr und cry Mutanten zeigten hinsichtlich Wachstum und Pigmentzusammensetzung weder unter photoautotrophen und heterotrophen Wachstumsbedingungen noch im Dauer-Blau- oder Rotlicht einen vom Wildtyp abweichenden Phaenotyp. Im UV-B ist in der cry Mutante im Gegensatz zur phr Mutante und dem Wildtyp die de novo Synthese fuer das D1 Protein des Photosystem II nicht induziert. In der cry Mutante ist ferner die Phototaxis zum Rot- und Dunkelrotlicht reduziert. Mittels quantitativer RT-PCR-Analysen wurde die lichtabhaengige Induktion der Transkription des psbA3 Gens, das fuer das Photosystem II D1 Protein kodiert, ueber einen großen Spektralbereich und beim Wechsel von niedriger zu hoher Fluenzrate untersucht. Unter den gewaehlten Lichtbedingungen ist mit Ausnahme von Dunkelrot in der cry Mutante die psbA3 Induktion abgeschwaecht, besonders drastisch im UV-A-Bereich. Somit wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass sll1629 fuer ein Cryptochrom kodiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Protein At5g24850 (At-cry3) aus Arabidopsis thaliana untersucht. At-cry3 ist 569 Aminosaeuren gross und besitzt ueber einen Bereich von 400 Aminosaeuren ca. 50 Prozent Identitaet zu Synechocystis cry. Durch in vitro Import und GFP-Lokalisationsstudien wurde nachgewiesen, dass die N-terminalen 63 Aminosaeuren von At-cry3 notwendig und hinreichend fuer den Import dieses Proteins sowohl in Mitochondrien als auch in Chloroplasten sind. At-cry3 wurde als His-tag-Fusion heterolog in E. coli ueberexprimiert. Spektroskopische Analysen zeigten, dass At-cry3 nicht kovalent FAD bindet. Weder spektroskopisch noch mit Duennschichtchromatographie konnte ein zweiter Kofaktor nachgewiesen werden. Durch Expression von At-cry3 in einem Photolyase-defizienten E.-coli-Stamm und in vitro und in vivo Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass At-cry3 keine Photolyaseaktivitaet besitzt. Ferner zeigten in vitro DNA-Bindungsstudien, dass At-cry3 sequenzunspezifisch an einzel- und doppelstraengige DNA bindet. Die Frage, ob At-cry3 eine Mutation in Synechocystis cry komplementieren kann, kann mit den vorliegenden Daten noch nicht abschliessend beantwortet werden. In Zusammenarbeit mit unserer AG hat Peter Lockhart, Massey University, New Zealand, einen Stammbaum mit ueber 70 Mitgliedern der Photolyase/Cryptochrom-Familie erstellt. Dieser deutet an, dass Pflanzen ihre Cryptochrome durch einen dualen horizontalen Gentransfer erhalten haben koennten: das CRY3 Gen von Cyanobakterien, den Vorlaeufern der Plastiden, Gene der CRY1/CRY2-Familie von Aplpha-Proteobakterien, den Vorlaeufern heutiger Mitochondrien.