Vergleich eines neu entwickelten immunologischen Nachweissystems für die gentechnisch veränderten Roundup Ready® Sojabohnen mit einer DNA-analytischen Methode anhand verschiedener Lebensmittelmatrices

摘要

In der vorliegenden Arbeit wird die Entwicklung eines immunochemischen Nachweisverfahrens für gentechnisch veränderte Roundup Ready® Sojabohnen (RR®-Soja) beschrieben. Anhand unterschiedlich prozessierter Lebensmittel sowie Modelllebensmitteln und Bohnenrohmaterial wird der Vergleich der neu entwickelten Methode gegenüber dem bereits bestehenden, auf DNA-analytischer Basis beruhenden Verfahren L 23.01.22-1 gemäß ß 35 LMBG, dargestellt. Zur Extraktion des gesuchten neu in die Pflanze eingeführten Zielproteins der 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase (E.C. 2.5.1.19, EPSPS) aus Agrobacterium sp. CP4 (CP4 EPSPS) wurde eine Extraktionsmethode etabliert, um flüssige Extrakte für die anschließende Trennung in der Polyacrylamidgelelektrophorese bereit zu stellen. Die besten Resultate wurden mit den Puffern H2O, 0,01 M PBS und einem Borat-haltigen Puffer zunächst an Bohnenrohmaterial bei 37 C und 30 min Dauer erreicht. Die Entwicklung des immunologischen Nachweissystems beruhte auf der Westernblottechnik, deren Detektionssystem über eine Antigen-Antikörperreaktion abläuft. Zur Herstellung der für das System benötigten Antikörper wurde zunächst das Antigen als Fusionsprotein über eine Expressionsklonierung in E. coli bereitgestellt. Nach dessen retardierender Reinigung über eine Nickel-Affinitätssäule wurden zwei New Zealand White Kaninchen über einen Zeitraum von 60 Tagen mit zweimaligem boostern zur Gewinnung der Antiseren immunisiert. Die Antiseren wurden im Anschluss auf ihre Spezifität und Sensitivität hin untersucht. Da das Serum von Kaninchen 1 starke Kreuzreaktionen gegenüber anderen Vertretern der Familie der Leguminoseae zeigte, die auch durch eine affinitätschromatographische Reinigung nicht beseitigt werden konnten, wurde nur Serum 2 zur weiteren Entwicklung des Testsystems berücksichtigt. Die praktische Nachweisgrenze des Systems wurde im Anschluss mit dem verbliebenen Antiserum mit 0,5 % RR®-Soja anhand von zertifiziertem Referenzmaterial bestimmt. Beim nachfolgenden Vergleich der beiden Untersuchungsmethoden wurden insgesamt 28 verschiedene Proben, von denen 22 sicher eine Toleranz gegenüber dem Herbizid Roundup® besaßen, untersucht. Mit der immunochemischen Methode gelang in 9 der 28 Proben der Nachweis einer gentechnischen Veränderung. Mit dem DNA-analytischen Verfahren gelang der Nachweis in 22 der 28 Proben. Bei den 9 Proben, die im Westernblot als gentechnisch verändert erkannt wurden, handelte es sich durchweg um nicht prozessierte Lebensmittel oder um Lebensmittel, die gering prozessiertes Sojamehl enthielten. Alle anderen Proben waren mehr oder minder starken technologischen Prozessen ausgesetzt, so dass bei der Extraktion nicht mehr ausreichend lösliche Proteine für den Einsatz in die immunochemische Analytik bereitgestellt werden konnten. Die DNA-analytische Methode konnte ohne Probleme auch in den stark prozessierten Lebensmitteln wie z.B. dem Tofu oder dem Texturierten Vegetabilen Protein (TVP) noch eine gentechnische Veränderung nachweisen. Alle 28 Proben wurden im Anschluss mit der Real-time PCR (TaqManô Prinzip) auf ihren Gehalt an RR®-Soja untersucht. Mit dieser Methode ist es möglich, den prozentualen Anteil an RR®-Soja im Gesamterzeugnis zu ermitteln und damit die Einhaltung des derzeitig gültigen Schwellenwertes von 1 % in der EU (mit Inkrafttreten des Schwellenwertes von 0,9 % wird im Herbst des Jahres 2003 gerechnet) zu überprüfen.