Rapid and simple gas chromatography-mass spectrometry method for quantification of methylmalonic acid in plasma and urine: its application to the diagnosis of methylmalonic acidurias

摘要

L’aciduria metilmalonica rappresenta un gruppo di acidurie organiche che comprendono principalmente difetti metabolici della metilmalonil-CoA mutasi e difetti del metabolismo della cobalamina.udLe acidurie metilmaloniche (MMAs) sono un gruppo eterogeneo di errori congeniti del metabolismo caratterizzate biochimicamente dall’accumulo di metilmalonato nelle urine e in altri fluidi corporei. Le MMAs che coinvolgono esclusivamente l’attività enzimatica della metilmalonil-CoA mutasi (mut0, mut - ,cblA and cblB) sono definite MMAs isolate. I difetti che influiscono sul metabolismo della metilcobalamina (MeCbl), cofattore di più cicli metabolici, presentano un contemporaneo accumulo di acido metilmalonicico ed omocistinuria (cblC,cblD,cblF).udSebbene l’eziologia delle acidurie metilmaloniche sia eterogena il quadro clinico dei pazienti é simile. udNella maggior parte dei pazienti la sintomatologia si presenta, in età neonatale, con vomito ricorrente, disidratazione, epatomegalia, sofferenza respiratoria, ipotonia muscolare e progressiva alterazione dello stato di coscienza con probabile evoluzione in malattia ingravescente, coma profondo e morte.udLe alterazioni di laboratorio più importanti sono una severa cheto-lattico acidosi, un’ ipo o iperglicemia, una neutropenia, un’iperglicinemia ed un’iperammoniemia che, se non corrette con un pronto e specifico intervento terapeutico possono portare a gravi handicap o morte.udAbbiamo sviluppato un metodo rapido e sensibile in cromatografia gassosa e spettrometria di massa utilizzando il metodo di diluizione isotopica per la quantificazione dell’acido metilmalonico nelle urine e nel plasma, utile per la diagnosi delle MMAs e nel follow up.udLa diluizione isotopica con isotopi stabili è considerato il metodo gold standard per la misurazione dei metaboliti perché essendo l’isotopo lo standard ideale, risolve il problema dell’ efficienza dell’estrazione nei metodi che si avvalgono dell’ estrazione con solvente. udIl metodo richiede fasi successive: l'estrazione dalle urine e dal plasma con estrazione liquido-liquido, l'essiccazione dell’estratto e infine la derivatizzazione con BSTFA dei prodotti di estrazione per formare i trimetilsilil derivati prima di essere iniettati nel GC/MS. udIl metodo è stato validato seguendo un piano che comprende il campo di applicazione del metodo, le caratteristiche di efficacia del metodo e dei suoi limiti di accettazione.udI parametri esaminati nel processo di validazione sono stati: limite di rivelazione e quantificazione, accuratezza, precisione, linearità e il recupero del MMA.ud Per il MMA plasmatico con l’aggiunta dell’analita, il limite di rilevazione o il limite del bianco (media più 3 SD del bianco) è stato di 0,1 µmol/l ed il limite di quantificazione (media più 10 SD del bianco) 0.8 µmol/l; per il MMA urinario con l’aggiunta dell’analita, il limite di rilevazione o limite del bianco (media più 3 SD del bianco) è stato di 0,1 µmol/l ed il limite di quantificazione (media più 10 SD del bianco) 0,7 µmol/l. Il range di linearità per le urine ed il plasma è compreso tra 0,1-400 µmol/l. udI valori normali di acido metilmalonico (plasma e urine) sono stati ottenuti da 50 pazienti sani di controllo. Il metodo è stato validato clinicamente analizzando 10 campioni prelevati da pazienti con tre varianti fenotipiche della aciduria metilmalonica. Il metodo oltre alla suo uso nella routine clinica potrebbe essere utilizzato come metodo nei programmi screening.