Etude de la fonction du complexe Bms1p/Rcl1p dans les étapes précoces de la synthèse des ribosomes et des connexions entre synthèse et maturation du pré-ARN ribosomique chez Saccharomyces cerevisiae

摘要

Dans les cellules eucaryotes, la synthèse des ribosomes débute dans le nucléole par la transcription de l'ADN ribosomique (ADNr) par l'ARN polymérase I (pol. I). Cette transcription génère un transcrit ribosomique primaire précurseur des ARNr matures 18S, 5.8S et 25S. Ce transcrit s'associe de manière co-transcriptionnelle avec certaines protéines ribosomiques, un grand nombre de facteurs d'assemblage et de maturation et des petites particules ribonucléoprotéiques pour générer une grande particule pré-ribosomique initiale. Celle-ci subit un processus de maturation complexe qui débute dans le nucléole et se termine dans le cytoplasme où se forment les sous-unités ribosomiques matures. La synthèse des ribosomes est l'un des processus cellulaires les plus coûteux en énergie, il doit donc faire l'objet d'une régulation minutieuse et être coordonné aux autres processus cellulaires fondamentaux. Comme mentionné précédemment, la synthèse des ribosomes fait intervenir environ 200 facteurs d'assemblage et de maturation des particules pré-ribosomiques. La fonction de l'énorme majorité d'entre eux reste encore inconnue et un des challenges actuels dans le domaine est de comprendre leur rôle moléculaire précis. Une partie de mes travaux de thèse a consisté en une étude structure/fonction du complexe Bms1p/Rcl1p impliqué dans la synthèse des ribosomes chez la levure. Rcl1p et Bms1p sont deux protéines nucléolaires essentielles qui forment un complexe requis pour la maturation de la petite sous-unité ribosomique (40S). Bms1p est une GTPase et Rcl1p est une endoribonucléase qui catalyse le clivage du pré-ARNr au site A2, l'étape qui sépare les deux voies de maturation conduisant aux sous-unités ribosomiques 40S et 60S. L'équipe de notre collaborateur Sébastien Fribourg (IECB, Bordeaux) a résolu la structure cristallographique de Rcl1p en complexe avec un fragment de Bms1p et a identifié les résidus situés à l'interface entre les deux protéines. La substitution de certains de ces acides aminés affecte l'interaction entre Bms1p et Rcl1p in vitro et induit des défauts de maturation des pré-ARNr in vivo. Nous avons montré que ces défauts sont probablement dus à un problème d'incorporation de Rcl1p dans les particules pré-ribosomiques. En effet, Bms1p et Rcl1p sont importées dans le noyau sous forme d'un complexe grâce à la séquence de localisation nucléaire (NLS) de Bms1p. Les deux protéines sont ensuite recrutées simultanément au sein des pré-ribosomes après l'incorporation des modules UTP-A et UTP-B mais indépendamment du recrutement de Rrp5p. Nos résultats suggèrent par ailleurs que la liaison de Bms1p au GTP n'est pas nécessaire au recrutement du complexe. Suite au clivage en A2, les deux protéines sont ensuite toutes les deux dissociées des particules pré-40S avant l'incorporation de Rio2p. Nos données indiquent donc que l'interaction directe entre Bms1p et Rcl1p est cruciale pour l'incorporation du complexe dans les pré-ribosomes chez la levure. Une autre partie de mes travaux de thèse a porté sur l'étude de la protéine Rpf2p, un composant des particules pré-ribosomiques pré-60S requis pour la synthèse de la grande sous-unité ribosomique. Différentes données de la littérature suggèrent que Rpf2p interagit avec des facteurs associés à la chromatine de l'ADNr. Nous avons confirmé certaines de ces interactions et nos résultats suggèrent par ailleurs que Rpf2p est associée in vivo à la chromatine de l'ADNr et plus particulièrement aux copies transcriptionnellement actives. Ces données suggèrent que Rpf2p pourrait intervenir dans des mécanismes de modification de la chromatine nécessaires à la transcription par l'ARN Pol. I et en effet, des expériences de " run-on " nucléaire indiquent que la perte d'expression de Rpf2p affecte la transcription par l'ARN pol. I. Ces résultats préliminaires suggèrent que Rpf2p pourrait intervenir dans le couplage fonctionnel entre transcription de l'ADNr et maturation des particules pré-ribosomiques.