Diseño de nuevos sistemas lacasa-mediador: empleo de mediadores de origen natural y mejora de lacasas por evolución dirigida

摘要

El empleo de mediadores redox respetuosos con el medio ambiente y disponibles a bajo coste, junto con el diseño de lacasas a la carta, más estables o con eficiencias catalíticas mejoradas, facilitaría la aplicación del sistema lacasa-mediador en procesos de descontaminación o en procesos industriales de biotecnología blanca. Esta tesis aborda ambos objetivos, en primer lugar la búsqueda y caracterización de mediadores alternativos de origen natural, y en segundo lugar la evolución dirigida de lacasas de alto potencial redox, concretamente, la lacasa del basidiomiceto Pycnoporus cinnabarinus. Las capacidades mediadoras de compuestos fenólicos de origen natural relacionados con el polímero de lignina se demostraron durante la oxidación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH) y colorantes, profundizando en los mecanismos de oxidación seguidos por estos sitemas lacasa-mediador natural. Por otro lado, el péptido señal de la lacasa de P. cinnabarinus (PcL) se sustituyó por la secuencia líder del factor ? para conseguir su expresión funcional en Saccharomyces cerevisiae y poder llevar a cabo los experimentos de evolución dirigida. La secuencia ?-PcL se sometió al proceso de evolución, consiguiendo, mediante PCR mutagénica y recombinación in vivo en la levadura, la diversidad genética necesaria. Después de tres ciclos de evolución, el mejor mutante seleccionado presentó 800 veces más actividad frente a ABTS que el parental de partida (PcL), debido a un incremento en la secreción de la enzima y a un aumento en sus propiedades catalíticas.