Short promoters and translational control regions regulate the expression of Don Juan, Don Juan-Like and Min. It is supposed that the function of Don Juan and Don Juan-Like is redundant during spermiogenesis of Drosophila melanogaster.

摘要

Das testisspezifisch exprimierte Gen don juan (dj), sowie die in dieser Arbeit neu charakterisierten Gene don juan-like (dj-like) und min sind als Cluster auf dem 3. Chromosom organisiert. Ihre Expression erfolgt translationskontrolliert, d.h die Transkripte der Gene sind bereits in prämeiotischen Stadien vorhanden, aber das Protein wird erst in postmeiotischen Zellstadien translatiert. Das Don Juan-Protein kolokalisiert mit dem Chromatin während der Kern-Transformation und ist entlang der Flagellen elongierter Spermatiden detektierbar. Subzellulär ist das DJ-Protein in den mitochondriellen Derivaten und im Kern lokalisiert. Das benachbarte Gen dj-like zeigt Identität zu don juan, 70 % auf Nukleotidebene und 42 % auf Proteinebene. Da eine Beteiligung der drei Genprodukte an dem postmeiotischen Differenzierungsprozess der Spermatogenese wahrscheinlich ist, erscheint neben einer Analyse der don juan-, dj-like- und min-Genregulation eine Funktionsanalyse der kodierten Proteine sinnvoll. Die transgene Expression eines Myc-DJ-Like-Fusionsproteins in der männlichen Keimbahn unter genregulatorischer Kontrolle des dj-like Promotors ermöglichte die spezifische Lokalisierung des Fusionsproteins in den Flagellen elongierter Spermatiden sowie in den Spermatidkernen während der Chromatinkondensationsphase. Unter Verwendung von Promotor-Reportergenkonstrukten konnte im transgenen Organismus gezeigt werden, dass die Expression von dj-like und min ebenso wie von don juan von kurzen genvorgelagerten Sequenzen gesteuert wird. Während 200 bp stromaufwärts des Translationsstarts von min zur Expressionsregulation des min-Gens ausreichen, sind für die Regulation der Expression von dj-like 650 bp stromaufwärts des Translationsstarts ausreichend. Zudem konnte die für die Repression der dj-mRNA verantwortliche Region auf 35 bp direkt stromaufwärts des ATG in der 5‘ UTR des Gens eingegrenzt werden. In dem Leaderbereich des min-Gens wurde ebenfalls direkt stromaufwärts des ATG eine 30 bp umfassende Region identifiziert, welche die Translationskontrolle der min-mRNA vermittelt. Sequenzidentitäten beider Regionen von dj und min sind nicht vorhanden. Mit Hilfe eines kreuzungsgenetischen Experimentationsansatzes wurde festgestellt, dass das Boule Protein in die Translationskontrolle von min involviert ist und Einfluss auf die Expressionshöhe des Proteins hat. Eine transkriptionsreprimierende Funktion der Proteine DJ und DJ-Like wurde durch ektopische Expression der Fusionsproteine Myc-DJ und Myc-DJ-Like in Augenimaginalscheiben und daraus resultierenden Entwicklungsdefekten nahegelegt. Zur Klärung der Funktion von DJ, DJ-Like und Min sollte eine Ethylmethansulfonat (EMS)-Mutagenese dienen. Als Selektionskriterium wurde hierbei ein bei Mutation männlich steriler dj-, dj-like- und min-Phänotyp postuliert. Zwei mit EMS-mutagenisierte Fliegenlinien zeigten gegenüber einer dj-, dj-like- und min-defizienten Fliegenlinie einen männlich sterilen, bzw semisterilen Phänotyp. Nach einer molekularbiologischen Analyse der beiden potentiell dj-, dj-like- und min-mutanten Fliegenlinien konnte eine Mutation in allen drei Genen ausgeschlossen werden. Alternativ wurde mit Hilfe der RNAi-Technik das don juan-Gen posttranskriptional ausgeschaltet. Das „Gene-Silencing“ von don juan hatte keinen Phänotyp zur Folge. Eine funktionelle Redundanz der Proteine DJ und DJ-Like ist daher wahrscheinlich.