Proteolyse van systemische auto-antigenen en onderdrukking van systemische auto-immuniteit door gelatinase B/MMP-9

摘要

Bij de mens omvat de familie van de matrix metalloproteïnasen (MMPs) 24verschillende neutrale endopeptidasen. Deze proteasen komen tussen infysiologische processen zoals reproductie, ontwikkeling, immuniteit enweefselherstel. Ontregeling van MMP activiteit heeft echter pathogene effecten bij kanker, inflammatie, vasculaire ziekten, neurodegeneratieve aandoeningen en auto-immuunziekten. Gelatinase B/MMP-9 wordt vooral gesecreteerd door macrofagen en neutrofiele granulocyten tijdens inflammatie, maar wordt ook geproduceerd door veel andere immuun- en kankercellen. Proteolyse van auto-antigenen door MMP-9 genereert immunodominante restepitopen voor auto-reactieve T cellen. Dit werdreeds aangetoond voor de klieving van collageen type II in reumatoïde artritis,van ‘myelin basic protein’ en αB-crystalline in multiple sclerose, en vaninsuline in diabetes type I. Bovendien bleken MMP-9-deficiënte muizen minder gevoelig voor het ontwikkelen van symptomen in diermodellen van deze orgaanspecifieke auto-immuunziekten. Bijgevolg werd de vraag gesteld of MMP-9 ook systemische auto-antigenen kan klieven en hoe dit de ontwikkeling van systemischeauto-immuniteit zou beïnvloeden.Orgaan-specifieke auto-immuniteit is meestal gericht tegen een beperktaantal auto-antigenen die voorkomen in het aangetaste orgaan. Systemischeauto-immuunziekten worden daarentegen gekenmerkt door een breed spectrum aanauto-antigenen, vooral bestaande uit veel voorkomende intracellulaire eiwitten.Systemische lupus erythematosus of SLE is het type-voorbeeld van eensystemische auto-immuunziekte en wordt gekenmerkt door hoge titers vanauto-antistoffen tegen meer dan 100 verschillende intracellulaire and intranucleaireauto-antigenen. De vorming en afzetting van immuuncomplexen veroorzaaktinflammatie en weefselschade over het hele lichaam en tast vooral huid, nieren,gewrichten, longen, centraal zenuwstelsel en bloedvaten aan. In SLE veroorzaken genetische en omgevingsfactoren (bv. virale infecties, medicatie, toxines) een toename vanapoptose of geprogrammeerde celdood. Bovendien zijn verschillende mechanismenvoor het opruimen van apoptotische cellen verstoord. Bijgevolg zal de overmaat aan apoptotische cellen leiden tot secundaire necrose en openbarsten. Hierdoorworden intracellulaire eiwitten vrijgesteld in het extracellulair milieu, waar ze kunnen gemoduleerd worden door MMPs en andere proteasen, hetgeen een extra argument vormt voor de studie van MMP-9 in systemische auto-immuniteit.Om te bepalen of MMP-9 in staat is om systemische auto-antigenen teklieven, werd een systematische karakterisatie van het intracellulairesubstraatrepertoire of ‘degradoom’ van MMP-9 opgestart aan de hand van een1-dimensionele ‘degradomics’ methode. Om het necrotisch vrijstellen van intracellulaire eiwitten in SLE na te bootsen, werd een modelsysteem gebruikt van necrotische humane monocytische THP-1 cellen,met of zonder toevoeging van geactiveerd MMP-9. Op deze manier werd ‘adenylyl cyclase-associated protein-1’ of ‘CAP1’ geïdentificeerd als een nieuw enuitzonderlijk efficiënt substraat van MMP-9. CAP1 is een cytoskeleteiwit en een auto-antigeen in reumatoïde artritis en SLE. Bovendien, detecteerden we intact CAP1 in urines van patiënten met systemische auto-imuunziekten zoals SLE, Sjögrens syndroom en vasculitis, en in urines van gezonde personen. Verder werden geactiveerde vormen van MMP-9 teruggevonden in urinestalen van patiënten met klinische parameters van nierfalen, terwijl in urines van personen zonder nierziekte geen actief MMP-9 aanwezig was. Bovendien, werd in sommige urines van patiënten een omgekeerde relatie teruggevonden tussen de niveaus van intact CAP1 en van geactiveerd MMP-9, hetgeen suggereert dat CAP1 in vivo wordt afgebroken.Identificatie van bijkomende substraten was door de complexiteit van heteiwitmengsel niet mogelijk met een 1-dimensionele aanpak. Om op grotere schaalintracellulaire MMP-9 substraten te kunnen identificeren, werd eenvoudige engoedkope multidimensionele degradomics technologie ontwikkeld. Dezemultidimensionele methoden reduceren de complexiteit van het proteïnemengseldoor de eiwitten eerst te scheiden volgens hun netto-lading of isoëlektrischpunt met behulp van ionenuitwisselingschromatografie en vervolgens in eentweede dimensie volgens moleculair gewicht met behulp van SDS-PAGE encentrifugale filtratie. Toepassing van de multidimensionele degradomics technologie op THP-1 cytosol leidde tot de isolatie en visualisatie van ongeveer 200 kandidaatsubstraten waarvan een 70-tal geïdentificeerd werden m.b.v. tandem massaspectrometrie (MS/MS). Ongeveer 2/3 van deze kandidaatsubstraten was reeds bekend als auto-antigeen in verschillende auto-immuunziekten en kankers. Ook werden talrijke intracellulaire matrix eiwitten, zoals actine en tubuline, geïdentificeerd als nieuwe substraten van MMP-9. Deze resultatentoonden aan dat proteolyse van systemische auto-antigenen wel degelijk eenfunctie van MMP-9 kan zijn. Bovendien leidden deze data tot de suggestie dat proteolyse door MMP-9 vereist zou kunnen zijn om de overmaat aan toxische, immunogene intracellulaire (matrix) eiwitten en systemische auto-antigenen op te ruimen die worden vrijgesteld na extensieve necrose.Om de rol van MMP-9 in systemische auto-immuniteit in vivo te onderzoeken, werden muizengegenereerd die genetisch deficiënt zijn in MMP-9 en met de inactiverende lpr (lymfoproliferatie) mutatie in de apoptose-inducerende receptor Fas. C57Bl/6 muizen zonder functionele Fas receptor (B6lpr/lpr muizen) ontwikkelen matige lymfoproliferatie enchronische systemische auto-immuniteit op latere leeftijd en met weinigimmunopathologie. De additionele genetische knockout van MMP-9 in B6lpr/lpr muizen resulteerde echter in een versnelde en sterk toegenomen lymfoproliferatie met uitgesprokenlymfadenopathie en splenomegalie, en significant gereduceerde overlevingvergeleken met enkel deficiëntie van Fas. Bovendien leidde het ontbreken van MMP-9 in B6lpr/lpr muizen tot een verhoogde productie van auto-antistoffen tegen multipele auto-antigenen en tot meer uitgesproken auto-immune weefselschade. Vermits ‘intacte’ auto-antigenen betere stimuli bleken te zijn voor auto-antilichaamproductie, zou de onderdrukking van lpr-geïnduceerde systemische auto-immuniteit een gevolg kunnen zijn van de opruiming van immunodominante T- en B-cel epitopen in auto-antigenische substraten. Bijgevolg zou het ontbreken van MMP-9-gemedieerde proteolyse tot een bijkomend defect in opruiming kunnen leiden, hetgeen de ontwikkeling van systemische auto-immuniteit kan versnellen en bestaande auto-immuunreacties kan amplificeren.We kunnen dus besluiten dat MMP-9 een uitgebreid spectrum aan intracellulaire (matrix) proteïnen en systemische auto-antigenen kan klieven. Opruiming van intracellulaire eiwitten zou cruciaal kunnen zijn om immuuntolerantie te behouden na acute of chronische necrose, zoals voorkomendbij SLE. Bovendien werd MMP-9 geïdentificeerd als een beschermende factor ineen in vivo model van systemische auto-immuniteit. Deze pre-klinische studies hebben medische implicaties. Verschillende studies stellen immers voor om MMP remmers te gebruiken in SLE en andere systemische auto-immuunziekten. Onze data suggereren echter datmen voorzichtig moet omspringen met de studie van MMP inhibitie bij SLE, aangezien hierdoor systemische auto-immuunreacties kunnen ontstaan of geamplificeerd worden in patiënten met een ongunstige genetische achtergrond.