Functional investigation of the sugar-modified nucleic acid analogues TNA and CeNA

摘要

De afgelopen decennia werd veel onderzoek gedaan naar nucleïnezuur analo gen en hun monomere bouwstenen. Dit niet alleen omdat deze enzymatisch s tabiele nucleïnezuur analogen een belangrijke rol kunnen spelen in versc hillende domeinen zoals therapie (antisense en siRNA technologie, aptame ren, ribozymes, ..), diagnose (het gebruik van specifieke nucleïnezuur p robes) en biotechnolgie (PCR, sequentiebepaling), maar ook uit interesse naar het onstaan van het leven op aarde en meer concreet het onstaan va n de eerste moleculen die een rol spelen in het opslaan en de transmissi e van de genetische informatie. De suiker-gemodificeerde nucleïnezuur an alogen TNA (tetrose nucleïnezuur) en CeNA (cyclohexeen nucleïnezuur) vor mden het onderwerp van mijn doctoraatsonderzoek. TNA is, structureel, een eenvoudiger nucleïnezuur dan RNA, dat gesynthet iseerd kan worden uitgaande van natuurlijke beginproducten. Bovendien is TNA in staat te hybridiseren met DNA en RNA. Uitgaande van deze eigensc happen kan TNA beschouwd worden als een voorloper of alternatief van RNA bij het ontstaan van leven op aarde. In dit onderzoek werd aangetoond d at ribozymes (die beschouwd worden als katalysatoren in de eerste stadia van leven op aarde) die de gemodificeerde tetrose nucleosiden bevatten, hun catalytische activiteit bijna volledig verliezen. We kunnen daarom besluiten dat TNA structureel te sterk verschilt van RNA om het bestaan van een catalytisch actief RNA/TNA chimeer ribozyme toe te laten. Verder werd de enzymatische herkenning van TNA bouwstenen door polymerasen nag egaan. Hoewel threosyl nucleoside trifosfaten herkend worden door natuur lijke polymerasen is een enzymatische synthese van TNA beperkt tot twee opeenvolgende bouwstenen. Een tweede deel van dit onderzoek gaat dieper in op de enzymatische herk enning van cyclohexeen nucleoside trifosfaten. Dit onderzoek beoogt een enzymatische synthese van CeNA uitgaande van de trifosfaat bouwstenen. T ot nu toe is de aanmaak van CeNA oligomeren enkel mogelijk via een chemi sche synthese welke niet alleen omslachtig is, maar ook een overmaat aan reagentia vereist. Een enzymatische CeNA synthese zou een grote vooruit gang zijn en zou een eenvoudige productie van CeNA oligomeren toelaten, welke dan verder onderzocht kunnen worden voor hun rol in therapie, diag nose of biotechnolgie. CeNA is immers een stabiel nucleïnezuur analoog d at bovendien sterk hybridiseert met de natuurlijk nucleïnezuren DNA en R NA. Er werd aangetoond dat natuurlijke DNA polymerasen in staat zijn om tot zeven opeenvolgende cyclohexeen nucleoside trifosfaten in te bouwen in een DNA hybride. Deze synthese is echter niet efficient. Daarom werd met gestuurde evolutietechnieken getracht een polymerase te ontwikkelen dat beter geschikt is voor de incorporatie van cyclohexeen bouwstenen.&n bsp; ‘Compartmentalized self replication’ werd gebruikt voor de selectie van polymerasen met aangepaste substraat specificitieit. Uitgaande van polymerase bibliotheken waarbij diversiteit is geïntroduceerd in de A-mo tief en de B-motief regio van het Taq DNA polymerase konden verschillend e mutanten geselecteerd worden met een verbeterde CeATP incorporatie cap aciteit (in vergelijking met Taq wild type). Bijkomende diversiteit is e chter nodig om de processiviteit van de geselecteerde mutanten te verhog en.