Μοριακή ανάλυση της διαφορικής έκφρασης γονιδίων σε λεπιδόπτερα έντομα: Μελέτη της «αρχιτεκτονικής» του υποκινητή του γονιδιακού ζεύγους A/B.L9 στο μεταξοσκώληκα Bombyx mori μέσω ηλεκτροδιάτρησης

摘要

Σκοπό της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η μελέτη της «αρχιτεκτονικής» των υποκινητών, δηλαδή πώς συνδράμουν στην αναπτυξιακή εξειδίκευση της έκφρασης των γονιδίων του χορίου οι συγκεκριμένες θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων (C/EBP, GATA, HMGA, CHD1), ο προσανατολισμός τους, ο αριθμός τους ακόμα και οι μεταξύ τους σχετικές αποστάσεις. Ως βασική μέθοδο προσέγγισης, επιλέξαμε την τεχνική της ηλεκτροδιάτρησης (electroporation) μέσω της οποίας καθίσταται εφικτή η επιτυχής εισαγωγή και έκφραση γονιδιακών κατασκευών στα επιθηλιακά κύτταρα των ωοθυλακίων του μεταξοσκώληκα Bombyx mori. Οι κατασκευές αυτές είναι τμήματα ανασυνδυασμένου DNA που περιέχουν το γονίδιο αναφοράς lacZ, υπό τον έλεγχο άρτιων ή/και τροποποιημένων υποκινητών αντιπροσωπευτικών γονιδίων του χορίου. Η όλη προσέγγιση προσομοιάζει την in vivo κατάσταση.Από την παρούσα διατριβή προέκυψε ένα αναθεωρημένο πρότυπο για τη σωστή αναπτυξιακή ρύθμιση των Α/Β.L9 γονιδίων. Το πρότυπο αυτό περιλαμβάνει ένα αυστηρό πρόγραμμα πρόσδεσης -των προαναφερθέντων- μεταγραφικών παραγόντων σε συγκεκριμένα cis-ρυθμιστικά στοιχεία, των οποίων η προσβασιμότητα εξαρτάται από δύο νουκλεοσώματα, παρόντα στον υποκινητή.The primary aim of this thesis was to investigate how promoter “architecture” (number, orientation and position of transcriptional factor - C/EBP, GATA, HMGA, CHD1- binding sites) facilitates developmentally accurate chorion gene regulation. Towards this purpose, several mutated (and non-mutated) promoter regions of different developmental specificity chorion genes, were cloned upstream of a reporter gene (lacZ) to introduce these plasmid constructs into silkmoth follicle epithelial cells via electroporation as an efficient and quick method for transient expression (on ex vivo developing follicles).In this thesis, a revised model is proposed for the developmentally accurate regulation of the A/B.L9 chorion genes. This model comprises a strict binding “program” of the previously mentioned transcription factors on cis-regulatory elements, whose access is dependent on two nucleosomes located on the promoter.