ФОТОМЕТРИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕСС-ДЕТЕКЦИЯЧАСТИЧНО ВЫВЕДЕННЫХ ИЗ ДВОЙНОЙ СПИРАЛИОСТАТКОВ ТИМИНА КАК МЕТОД ПРЯМОГОСКАНИРОВАНИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙИ АПУРИНОВЫХ САЙТОВ ДНК

摘要

Разработан прямой фотометрической метод детекции внеспирanьных остатков.тимидина в гетеродуплексах ДНК при обработке их раствором перманганата калия. В основе метода лежит увеличение поглощения света в реакционной смеси при 420 им за счет накопления продуктов окисления тимидина и золя оксида марганца. Анализ проводили на серии 19-звенных ДНК-дуплексов, содержащих неспаренные тимидины, напротив которых в комплементарной цепи находилось производное тетрагидрофурана, имитирующее распространенное повреждение ДН К – апуриновый (АР) сайт, и на библиотеке 50-звенных ДН К, содержащих все типы неканонических пар в разном микроокружении. Исследована взаимосвязь между селективностью реакции окисления неспаренного остатка Т и термической стабильностью двойной спирали. Показано, что с помощью использованного подхода можно четко дискриминировать ДНК-дуплекеы с одним и двумя АР-сайтами, обнаружить тиминсодержащие мисматчи,'а также все типы неканонических пар в АТ-окружении. Впервые проведено сравнение результатов ССМ-анализа и фотометрического экспресс-метода при сканировании неканонических пар оснований ДНК на одной и той же модельной системе. Выявлена корреляция между эффективностью модификации остатков тимина и степенью локального нарушения двуспиралькой структуры, вызванного неправильно спаренным основанием. Поскольку фотометрический метод не требует стадии расщепления ДНК и электрофоретического разделения, он может быть легко автоматизирован и использован для первичного скрининга соматических мутаций.