ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНЫХ З-ГЕКСУЛОЗО-6-ФОСФАТСИНТАЗ У ГАЛОТОЛЕРАНТНОГО МЕТАНОТРОФА Methylomicrobium alcaliphilum 20Z

摘要

У аэробного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z ключевые ферменты рибулозомонофосфатного (РМФ) цикла ассимиляции углерода, З-гексулозо-6-фосфатсинтаза (HPS) и 6-фосфо-3-гексулозоизомераза (PHI), кодируются генами hps, phi и фьюженом hps-phi. Рекомбинантные HPS-His_6, PHI-His_6 и двудоменный белок HPS-PHI получены гетерологичной экспрессией в Escherichia coli и очисткой аффинной хроматографией. В присутствии PHI-His_6, HPS-His_6 (2 × 20 кДа) и HPS-PHI (2 × 40 кДа) катализировали образование фруктозо-6-ΦocΦaτa из формальдегида и рибулозо-5-ΦосΦата с активностями 172 и 22 Е/мг белка соответственно. Судя по значениям k_(cat)/K_m, HPS проявляла более высокую каталитическую эффективность, но меньшее сродство к формальдегиду по сравнению с HPS-PHI. AMP и ADP существенно ингибировали активность обеих гексулозофосфатсинтаз. Двудоменный белок HPS-PHI не обладал активностью изомеразы, но полипептиды, соответствующие его HPS и PHI регионам, экспрессированные раздельно, проявляли соответствующие синтазную и изомеразную активности. Инактивация слитого гена hps-phi не выявила фенотипических различий между мутантным и исходным штаммами М. alcaliphilum. Анализом аннотированных геномов обнаружены гены hps и phi у всех метилотрофов с РМФ путем С_1-ассимиляции, тогда как слитый ген hps-phi присутствует только у некоторых метанотрофов, но не найден у нерастущих на метане метилобактерий. Обсуждается значение этих тандемов в адаптивном и биотехнологическом потенциале метилотрофов.