Structural features and functional domains of amassin-1, a cell-binding olfactomedin protein

摘要

Amassin-1 mediates a rapid cell adhesion that tightly adheres sea urchin coelomocytes (body cavity immunocytes) together. Three major structural regions exist in amassin-1: a short β region, 3 coiled coils, and an olfactomedin domain. Amassin-1 contains 8 disulfide-bonded cysteines that, upon reduction, render it inactive. Truncated forms of recombinant amassin-1 were expressed and purified from Pichia pastoris and their disulfide bonding and biological activities investigated. Expressed alone, the olfactomedin domain contained 2 intramolecular disulfide bonds, existed in a monomeric state, and inhibited amassin-1-mediated clotting of coelomocytes by a calcium-dependent cell-binding activity. The N-terminal β region, containing 3 cysteines, was not required for clotting activity. The coiled coils may dimerize amassin-1 in a parallel orientation through a homodimerizing disulfide bond. Neither amassin-1 fragments that were disulfide-linked as dimers or that were engineered to exist as dimers induced coelomocytes clotting. Clotting required higher multimeric states of amassin-1, possibly tetramers, which occurred through the N-terminal β region and (or) the first segment of coiled coils.L'amassine-1 permet une adhésion cellulaire rapide et solide entre les coelomocytes (immunocytes) chez l'oursin de mer. Trois régions structurales majeures se retrouvent dans l'amassine-1: une courte région β, trois régions coiled-coil et un domaine olfactomédine. L'amassine-1 contient 8 cystéines impliquées dans la formation de ponts disulfures dont la réduction inactive la protéine. Des formes tronquées de l'amassine-1 recombinante ont été exprimées et purifiées chez Pichia pastoris et la formation de ponts disulfures ainsi que l'activité biologique ont été examinées. Lorsqu'exprimé seul, le domaine olfactomédine comportait 2 liens disulfures intramoléculaires, existait sous forme monomérique et inhibait l'agrégation des coelomocytes dépendante de l'amassine-1 par un mécanisme de liaison aux cellules dépendant du calcium. La région β N-terminale contenant 3 cystéines n'était pas requise pour l'agrégation. Les motifs coiled-coil permettaient la dimérisation de l'amassine-1 en orientation parallèle par l'intermédiaire d'un lien disulfure permettant l'homodimérisation. Les fragments de l'amassine-1 liés en dimères par des ponts disulfures ou manipulés par ingénierie pour former des dimères n'induisaient pas l'agrégation des coelomocytes. L'agrégation requérait un niveau plus élevé de multimérisation, probablement la tétramérisation, impliquant la région β N-terminale et/ou le premier segment coiled-coil.