轮状病毒NSP1和NSP3蛋白真核表达载体构建、表达及其调控Ⅰ型干扰素信号通路的功能

摘要

【目的】旨在构建轮状病毒(Rotavirus,RV)非结构蛋白1(NSP1)和3(NSP3)真核表达载体,并在人胚肾上皮HEK239T细胞中表达,随后研究轮状病毒NSP1和NSP3在体外初步影响IFN-β/ISRE报告基因活性。【方法】首先合成猿轮状病毒SA11株NSP1、NSP3编码基因连接到克隆载体pUCm-T上,通过PCR技术扩增目的片段,再以真核表达载体pRK-Flag、pRK-HA为骨架构建出可特异性表达重组蛋白pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1、pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3的真核表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到HEK293T细胞中,通过Western blot鉴定NSP1/NSP3蛋白的表达。随后,将重组质粒pRK-Flag-NSP1/pRK-Flag-NSP3与IFN-β-Luc/ISRE-Luc质粒共转染至HEK239T细胞,经RIG-IN(RIG-I活化结构域)的刺激后利用双荧光素酶报告基因系统判定NSP1/NSP3蛋白对IFN-β/ISRE报告基因活性的影响。【结果】成功克隆了NSP1和NSP3全长基因,构建了猿轮状病毒SA11株NSP1、NSP3蛋白真核表达质粒pRK-Flag-NSP1/pRK-HA-NSP1、pRK-Flag-NSP3/pRK-HA-NSP3,并在HEK293T细胞中转染表达,Western blot确定了NSP1和NSP3蛋白成功表达。重组质粒pRK-Flag-NSP1和pRK-Flag-NSP3可显著降低RIG-IN诱导的双荧光素酶活性。【结论】NSP1和NSP3蛋白可抑制RIG-IN刺激的IFN-β和ISRE启动子活性,证明NSP3蛋白和已报道的NSP1蛋白一样具有抑制IFN-β信号通路的功能,为深入研究NSP3蛋白调控Ⅰ型干扰素信号通路的作用机制奠定理论基础。