EMA-qPCR方法快速检测番茄溃疡病菌活菌研究

摘要

将叠氮溴乙锭(EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合(EMA-qPCR),建立一种有效快速检测番茄溃疡病活菌的方法.以番茄溃疡病菌Pat-1基因为检测靶标,菌体经EMA渗透处理,再进行qPCR特异性扩增.结果显示,qPCR检测灵敏度为1.0×101CFU/mL;当EMA的浓度为2.0μg/mL时,能有效抑制1.0×107 CFU/mL灭活死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响.当活菌数在1.0×101-1.0×105 CFU内,每个qPCR反应体系中活菌CFU数与Ct值呈线性相关(R2 =0.987).不同温度处理后EMA-qPCR检测番茄溃疡病菌的存活情况并与平板计数法进行比较,表明待检样品可在4和20℃短期保存.对疑似带病番茄种子样品进行EMA-qPCR检测,发现EMA-qPCR方法能减少番茄溃疡病菌PCR检测的假阳性结果.本研究建立的EMA-qPCR方法是一种能有效检测番茄溃疡病活菌的方法,并能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果.