凋亡程度对客观诊断卵巢癌细胞耐药性价值的研究

摘要

目的寻找一种能够全面、客观地反映卵巢癌细胞耐药程度变化的指标.方法采用人类上皮性卵巢癌细胞株A2780和由它诱导的耐顺铂细胞株AD4,在四甲基偶氮唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide,MTT)法测定耐药倍数的基础上,以逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase ChainReaction,RT-PCR)检测耐药基因mdrl、TopoⅡα和GSTπ的表达情况,并以G3PDH作内参,进行半定量分析;同时进行DNA梯度电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡情况以反映耐药程度的变化,并比较几种方法用于检测耐药的优劣.结果经MTT测定卵巢癌敏感细胞株A2780的IC50为19.2,耐药细胞AD4的IC50为66μg/ml,耐药倍数为3.4.RT-PCR检测A2780和AD4中mdrl的表达都非常低,与G3PDH的比值分别为0.09±0.03及0.10±0.02,且在敏感及耐药细胞株中的表达差异无显著性;TopoⅡα在敏感细胞中的表达为2.60±0.12,耐药细胞为0.11±0.03,两组比较差异有显著性;而GSTπ则相反,在敏感细胞中的表达低于耐药细胞,比值分别为0.11±0.03和3.13±0.14,差异也有显著性,证实了卵巢癌对顺铂耐药主要是通过TopoⅡα和GSTπ等途径,而非mdr1途径.但在所取时间点(6h、12h、24h)内各基因表达未发现明显差异.可见RT-PCR虽可特异性检测几种耐药基因的表达,但由于耐药机制的多样性,检测往往不够全面,同时受细胞增殖周期的限制,此方法不能在短时间内反映耐药程度的变化;用DNA梯度电泳方法检测凋亡,在顺铂作用A2780及AD4 24h、48h后均有180～200bp整数倍的均匀梯度产生,此方法虽对凋亡的检测较具特异性,但只能检测晚期凋亡且只能做定性分析;流式细胞仪检测凋亡在用药后几小时即可发现各实验组耐药性的差异,实现了对耐药进行早期、定量检测的目标;并且通过检测凋亡反映耐药程度的变化不受耐药机制的限制,使结果较为全面、客观.结论以流式细胞仪检测凋亡程度而反映耐药,避免了只检测某种耐药基因时可能产生的漏诊,是一个能够较全面、客观地反映卵巢癌细胞耐药程度变化的指标,同时它还具有检测早期耐药性变化及能够定量分析等优点,虽仍有一些问题存在,但通过我们进一步深入研究,并改善标本取材及实验操作方法后将对临床上诊断耐药提供一个可信度较高的客观指标,有望结束目前对耐药的诊断仅评主观判断的历史.