miR-93对睾丸畸胎瘤细胞增殖、心肌分化的影响及其与NFATC3的调控关系

摘要

目的 观察miR-93对常用于心脏发育研究的睾丸畸胎瘤细胞P19增殖与心肌分化的影响,并分析其与活化T细胞核转录因子3(NFATC3)在此过程中的调控关系.方法 将P19细胞分为三组,miR-93组、NC组分别转染miR-93 mimic及阴性对照空白质粒,对照组不转染;采用CCK-8法观察转染0、24、48 h后miR-93对P19细胞增殖的影响,Western blotting法检测miR-93对心肌分化标志基因心肌肌钙蛋白T(cTnT)与锌指转录因子CATA结合蛋白4(GATA4)的影响.通过TargetScanhuman7.2数据库筛选发现NFATC3为miR-93的下游靶基因,通过双荧光素酶基因报告验证两者的结合情况;采用Western blotting法检测miR-93对P19细胞中NFATC3表达的影响.再将P19细胞另分为三组,miR-93组、miR-93+NFATC3组及NC组分别转染miR-93 mimic、miR-93 mimic+NFATC3 mimic及阴性对照空白质粒,采用CCK-8法、Western blotting法观察NFATC3对miR-93过表达所致细胞增殖及心肌分化的影响.结果 miR-93组除0h外同时点细胞OD值及cTnT、GATA4蛋白表达均低于NC组及对照组(P均＜0.05),NC组与对照组各指标比较差异无统计学意义.转染NFATC3 wt+NC质粒的P19细胞荧光素酶相对活性与转染NFATC3 wt+miR-93 mimic质粒的细胞比较有明显差异(P＜0.01);转染NFATC3 mut+NC质粒的P19细胞荧光素酶相对活性与转染NFATC3 mut+miR-93 mimic质粒的细胞比较无统计学差异.miR-93组NFATC3蛋白表达低于对照组及NC组(P均＜0.05),除0h外同时点细胞OD值及cTnT、GATA4蛋白表达NC组＞miR-93+NFATC3组＞miR-93组(P均＜0.05).结论 miR-93可抑制P19细胞增殖及心肌分化,该作用可能通过沉默NFATC3表达来实现,或可为先天性心脏病提供潜在的治疗靶点.