卵巢癌细胞自噬后4种miRNAs表达变化及miR-144对mTOR的靶向调控作用

摘要

目的 观察雷帕霉素诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬后miR-18a、miR-19a、miR-21及miR-144表达的变化,并以miR-144为研究对象,验证其对自噬相关基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(mTOR)的靶向调控作用.方法 分别用50 ng/mL雷帕霉素(雷帕霉素组)及10 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA组)作用于SKOV3细胞2、12 h,收集细胞,并设立不进行任何处理的细胞作为对照组,提取总RNA;应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测4种miRNAs的表达水平.培养SKOV3细胞,设立正常细胞组、miR-144 mimic组和miR-144 inhibitor组,分别将合成的miR-144 mimic及miR-144 inhibitor转染到SKOV3细胞内,正常细胞组不处理.应用qRT-PCR方法检测各组的miR-144及mTOR mRNA表达量,应用Western blotting法检测各组细胞中mTOR蛋白表达量.应用双荧光素酶报告系统验证miR-144与mTOR的相互作用关系.结果 对照组细胞miR-18a、miR-19a、miR-21及miR-144的表达量分别为1.003±0.021、1.001±0.039、1.014±0.016、1.028±0.037;雷帕霉素组4种miRNAs的表达量分别为6.310±0.025、1.200±0.058、52.310±0.005、63.490±0.024,其miR-18a、miR-21及miR-144高于对照组(P均<0.05);3-MA组SKOV-3细胞的4种miRNAs的表达量分别为0.540±0.019、0.890±0.062、0.820±0.012和0.660±0.003,其miR-18a及miR-144低于对照组(P均<0.05).与正常细胞组比较,miR-144 mimic组miR-144 mRNA表达量高(P<0.05),mTOR mRNA和蛋白的表达量降低(P均<0.05);miR-144 inhibitor组miR-144表达量下降(P<0.05),mTOR mRNA和蛋白的表达量升高(P均<0.05).miR-144 mimic分别与mTOR-WT及mTOR-Mut共转染,前者的荧光表达量低于后者(P均<0.05).结论 SKOV3细胞发生自噬后,miR-18a、miR-21及miR-144表达升高, miR-144可靶向抑制mTOR的表达.