捻转血矛线虫Hc-hrg-2拯救血红素缺陷型酵母生长表型

摘要

[目的]已有研究表明捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)Hc-hrg-2属于血红素应答基因,高浓度血红素的刺激可导致该基因的转录水平上调,但其在血红素调控中的功能尚缺乏研究.研究通过同源重组技术构建血红素合成缺陷型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)hem1敲除株,通过异源表达Hc-hrg-2对该敲除株进行表型拯救试验,以期验证Hc-hrg-2参与细胞内血红素转运的功能.[方法]以S.cerevisiae BY4741基因组为模板,设计引物,扩增获得hem1(SGD:S000002640)基因序列5'和3'侧翼区同源臂;同时以pYES2-CT质粒为模板设计引物,扩增获得筛选标记URA3序列;利用两次重叠PCR技术依次将测序正确的上游同源臂、URA3、下游同源臂序列串联成基因敲除组件,并通过醇沉法对敲除组件进行纯化.采用醋酸锂转化法将纯化的敲除组件转化至BY4741感受态细胞中,经SD/-URA(含250μmol·L-15-氨基乙酰丙酸(ALA))培养基筛选,并利用多对引物进行PCR鉴定,以验证Δhem1敲除株的正确性.同时以含有H.contortus浙江株Hc-hrg-2序列(GenBank:MK371241)及其功能域缺失序列Hc-hrg-2(Δgst-n)和Hc-hrg-2(Δgst-c)的质粒为模板,利用特异性引物分别进行PCR扩增,通过无缝克隆将扩增得到的目的片段插入酵母pESC-LEU表达载体,经PCR鉴定以及测序验证后,采用醋酸锂转化法将正确的表达载体转化至Δhem1感受态细胞中,通过SD/-URA/-LEU(含250μmol·L-1 ALA)培养基筛选以及PCR鉴定验证阳性异源表达株的正确性.通过比较Δhem1敲除株及其各异源表达株在含有或不含有250μmol·L-1 ALA的SD/-URA/-LEU液体培养基中的生长情况,进一步验证敲除株的表型同时排除表达载体对表型的影响.用2％半乳糖对含有阳性表达质粒的敲除株进行诱导,取部分菌液进行超裂破碎,收集蛋白,通过Western Blot鉴定目的蛋白的表达;剩余菌体用去离子水重悬至OD600=0.2,用去离子水进行5倍比稀释,取4μL稀释后的菌液点至含有250μmol·L-1 ALA或者不同浓度血红素的诱导平板上,28°C培养2—3 d后比较敲除株的生长情况.[结果]成功获得hem1基因敲除株 Δhem1,与野生株相比,Δhem1不能合成血红素,需外源添加ALA(250μmol·L-1)或血红素(≥10μmol·L-1)才能生长,且异源表达株和敲除株的表型一致.Western Blot结果表明2％半乳糖能诱导Hc-hrg-2及其功能域缺失基因在敲除株中成功表达,且表达Hc-hrg-2能够在低血红素浓度下(≤1μmol·L-1)促进酵母对血红素的摄取,拯救敲除株的生长缺陷,其硫氧还蛋白样结构域(GST-N)和谷胱甘肽S-转移酶C末端结构域(GST-C)的缺失会降低拯救的效果.[结论]捻转血矛线虫血红素应答基因Hc-hrg-2可促进细胞对血红素的摄取,其GST-N和GST-C功能域在该过程中发挥着重要作用,研究成果为后续深入研究捻转血矛线虫的血红素转运机制奠定基础.