玉米大斑病菌漆酶基因Stlac2结构分析及原核表达

摘要

[目的]对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)漆酶基因St1ac2进行生物信息学分析,推测其蛋白功能,探究木质素降解过程中产生的小分子物质对St1ac2表达的影响,并对其进行克隆及原核表达,以便深入研究该基因在病菌生长、发育及致病过程中的作用.[方法]通过NCBI查询获得玉米大斑病菌EOA90070 (St1ac2)基因的全序列,通过ClustalX与马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)PbrB (PMAA_082060)基因、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Abr2 (AFUA_2G17530)基因、构巢曲菌(Aspergillus nidulans)YA (AN6635)基因等漆酶家族基因进行蛋白序列比对,查看St1ac2中的铜离子结合位点,利用在线软件SOPMA和ProtParam对其二级结构及理化性质进行检测,通过SWISS--MODEL对St1ac2蛋白质的三维结构进行预测,采用SAVES对三维结构进行评价.通过对ABTS的氧化试验确定木质素降解过程中产生的小分子物质对玉米大斑病菌漆酶产量的影响;利用RT-qPCR方法分析小分子物质对St1ac2表达规律的影响;采用原核表达系统,以pET-30a表达载体为框架,对其进行原核表达,并将表达蛋白纯化,以ABTS为底物,420 nm下检测漆酶活性.[结果]St1ac2具有典型的Cu离子结合位点,与漆酶典型的Cu离子结构域相似.其蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为18.59％、25.63％、11.91％和43.86％,分子量为61.64 kD,等电点为5.00,平均疏水性为-0.37,表明其为亲水蛋白,当在PDA中添加0.01 g·L-1香草醛、4-羟基苯甲醛、丁香醛、香草酸、4-羟基苯甲酸和香兰素时,玉米大斑病菌胞外漆酶的产量为香草酸＞香兰素＞4-羟基苯甲醛＞4-羟基苯甲酸＞丁香醛＞对照.而在4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸存在时,玉米大斑病菌St1ac2的相对表达量明显升高,约为对照的5-8倍.利用原核表达系统,在67 kD处成功诱导表达出一条特异性蛋白条带,大量表达纯化后,漆酶活性为(40.7 ±0.3) U·L-1.[结论]阐明了St1ac2的生物信息学特性,初步断定其为漆酶基因;4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲酸可显著提高St1ac2相对表达量,表明其在木质素降解过程中起到了一定的作用;该基因所编码的蛋白可通过pET-30a原核表达系统表达,体外漆酶活性可达(40.7±0.3) U·L-1,该研究结果为后期研究蛋白性质打下了基础.