GmHMADP参与高温高湿下大豆种子活力形成及铜镉胁迫响应的研究

摘要

[目的]高温高湿、重金属等非生物胁迫是制约大豆生产,影响种子发育和品质的重要因素.通过对大豆GmHMADP的研究,揭示其在重金属镉、铜和高温高温胁迫下的表达水平以及功能,以期为培育高活力的逆境耐受性大豆新品种提供理论依据和实践基础.[方法]利用Primer Premier 5.0软件设计引物,以宁镇1号和湘豆3号2个品种叶片的cDNA为模板,分离大豆GmHMADP全长cDNA序列.通过NCBI网站BLAST对GmHMADP同源性氨基酸序列进行搜索,并用DNAMAN软件进行氨基酸序列比对.同时,以XhD Ⅰ和Sa1Ⅰ为酶切位点构建35S∷GmHMADP-GFP融合表达载体,分析其在烟草叶肉细胞的瞬时表达,进行亚细胞定位.利用实时荧光定量PCR技术对GmHMADP的组织特异性表达及其在高温高湿和CuSO4、CdCl2处理下的表达进行分析.以XbaⅠ和BamHⅠ为酶切位点,利用pBI121载体,构建融合表达载体,将GmHMADP在野生型拟南芥中过表达,获得3个纯合的T3转基因株系,对高温高湿胁迫下拟南芥的种子活力以及过表达拟南芥植株对铜、镉胁迫的耐受性进行分析.[结果]获得大豆GmHMADP全长cDNA序列,该基因包含1个996 bp的完整开放阅读框,具有4个外显子和3个内含子.多序列比对结果表明,GmHMADP氨基酸序列含有2个金属离子结合位点特征序列CXXC.亚细胞定位结果表明GmHMADP蛋白定位于细胞膜与细胞核上.组织特异性分析结果表明,GmHMADP在宁镇1号和湘豆3号2个品种的发育和成熟中的种子中表达量较高.与相应的对照组相比,在宁镇1号种子中,高温高湿胁迫48、96和168 h后,GmHMADP的表达量显著(P＜0.01)升高;在抗性品种湘豆3号中,该基因在处理24、48、96和168 h时表达量显著(P＜0.01)升高;湘豆3号中,GmHMADP的表达量在不同浓度Cu2+、Cd2+的诱导下均显著(P＜0.01)升高;而宁镇1号中,GmHMADP的表达量仅在50 μmol·L-1 Cu2+和200 μmol·L-1 Cd2+处理下显著(P＜0.01)升高.GmHMADP过表达拟南芥株系经高温高湿胁迫后的发芽势、发芽率及种子活力均显著(P＜0.01)高于野生型植株;经Cu、Cd胁迫后,转基因拟南芥株系的根长和干重均显著(P＜0.05)高于野生型植株.[结论]GmHMADP参与高温高湿胁迫下种子活力的形成并响应Cu、Cd胁迫,在拟南芥中过表达GmHMADP可提高拟南芥的种子活力以及对Cu、Cd胁迫的耐受性.