基于探针底物法的高效液相色谱-串联质谱法研究蚯蚓体内CYP1A2、CYP2C9与CYP3A4酶活力

摘要

按规定方法解剖蚯蚓取得其内脏,经清洗后转移至盛有4mL匀浆缓冲液的组织研磨器中均匀破碎,并将匀浆体积定为6.0mL。将此匀浆液通过差速离心法取其微粒体(即第2次离心后的沉淀物)用3mL保存缓冲液重新悬浮,制得蚯蚓微粒体蛋白悬浮液。将此悬浮液100μL加入于含孵育体系650μL及探针底物混合液(含非那西汀100μmmol·L^-1、双氯芬酸钠100μmmol·L^-1和睾酮25μmmol·L^-1)250μL中,升温至37℃,孵化20min,加入甲醇200μL中止反应。离心10min,取其上清液,经0.22μm滤膜过滤。所得滤液流经Acquity HPLC C18色谱柱(50mm×2.1mm,1.8μm),并用不同体积比的(A)每升溶液中含甲酸0.5mL的1mmol·L^-1乙酸铵溶液和(B)甲醇组成的混合液作为流动相进行梯度洗脱,使所加入的3种底物被蚯蚓体内的细胞色素P450亚酶的催化作用而相应产生的3种特异代射物分离。然后在电喷雾正离子源和多反应监测模式条件下,用串联质谱法测得其含量。结果表明:所述3种代谢物(对乙酰氨基酚、4′-羟基双氯芬酸、6β-羟基睾酮)的线性范围依次在0.40,0.20,10.0μg·L^-1以内,检出限(3S/N)依次为0.008,0.005,0.1μg·L^-1。根据所测得3种代谢物的生成量可分别评价蚯蚓体内3种相应的亚酶CYP1A2、CYP2C9和CYP3A4活力。此外,还对受敌敌畏染毒的土壤中培养3d和14d后的蚯蚓样品,按上述方法分析,获得了染毒的土壤对蚯蚓体内上述3种CPY亚酶活力的变化情况。所得结果可作为土壤污染全面诊断的生物标记。