桦褐孔菌膜二肽酶在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

摘要

本研究利用巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris蛋白表达体系表达了药用担子菌桦褐孔菌的一个二肽酶基因.该二肽酶基因编码区全长1 814bp,包含6个内含子,编码465个氨基酸.生物信息学分析发现,二肽酶基因编码的蛋白中不含信号肽序列,但在第55-77位氨基酸之间存在一个跨膜结构.将含跨膜结构和去跨膜结构蛋白的cDNA序列分别克隆到酵母分泌型表达载体pPICZαA上,电转化至巴斯德毕赤酵母X-33中,用1％(v/v)甲醇诱导重组菌株表达目标蛋白,采用SDS-PAGE和Western-blot检测表达蛋白.结果 显示,巴斯德毕赤酵母可表达含跨膜结构的完整基因,但目标蛋白不能分泌到胞外,存在于破碎细胞的沉淀中,且没有催化活性;而去跨膜结构的蛋白则可分泌表达到胞外,并具有催化活性.Ni-NTA纯化去跨膜结构的桦褐孔菌二肽酶浓度可达0.12mg/mL,并发现其在pH 7.3、反应温度50℃、反应时间2h的条件下,以Gly-Gly为底物时,其比活为433U/mg.同时检测到其对Ile-Leu、Trp-Trp和Phe-Phe具有较高的水解活性.