里氏木霉双基因同步缺失菌株的构建与甘露聚糖酶表达研究

摘要

在里氏木霉中建立了一个快速的双基因位点同步同源重组新方法,较好解决了里氏木霉基因逐个敲除周期长等问题.研究以里氏木霉自身甘露聚糖酶基因(man5A)为重组表达的报告基因,通过一步转化,将该基因定点整合入纤维二糖水解酶Ⅰ (cbh1)基因位点,同时缺失主要的两个纤维素酶基因(cbh1、cbh2),得到重组工程菌Man12.将重组工程菌Man12与出发菌株Tu6△ku70进行摇瓶发酵,结果显示,重组菌株的甘露聚糖酶产量比出发菌株提高10倍,而纤维素酶产量降低了60％,胞外总蛋白分泌水平降低了40％.Real-time PCR检测甘露聚糖酶基因(manSA)的转录水平,发现重组菌株较出发菌株提高了25倍.在里氏木霉中首次报道了通过一步转化实现两个基因同步定点整合的方法,对利用基因工程手段构建高效表达重组蛋白的里氏木霉工程菌株具有一定的指导意义.