前半胱天冬酶-1及活性位点突变真核表达载体的构建、表达及生物活性鉴定

摘要

目的构建和表达前半胱天冬酶（procaspase）-1及其活性位点C285A突变真核表达载体，并检测其生物学活性。方法从人胚肾细胞系HEK293中提取总RNA，逆转录后，PCR获得前半胱天冬酶-1全长DNA，并通过重组PCR获得其酶活性位点突变片段，酶切连接到载体pcDNA3-Flag中，经鉴定将阳性克隆测序；脂质体转染两种载体到HEK293中表达，用免疫印迹检测目的蛋白的表达，并用酶联免疫吸附方法检测在病原菌毒力蛋白刺激下，前半胱天冬酶．1及C285A对IL-1β分泌的影响。结果构建的2种真核表达载体能够在HEK293中很好表达，当前半胱天冬酶-1过表达时，病原菌毒力蛋白可以刺激IL-1β的分泌，而C285A酶活性位点突变之后，IL-1β的分泌明显降低。结论构建重组的pcDNA3-Flag—procaspase-1具有生物学活性，而C285A突变导致前半胱天冬酶1丧失切割底物的功能，且使IL-1B的分泌明显降低。