肿瘤坏死因子α通过抑制线粒体呼吸链复合体Ⅲ诱导L929-A细胞发生RIP1激酶依赖性细胞凋亡

摘要

目的探讨肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）诱导L929-A细胞发生受体相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein 1,RIP1）依赖性凋亡的分子机制。方法通过胰蛋白酶浓度梯度消化及蛋白质印迹法检测RIP1、胱天蛋白酶8（caspase-8）和Bid蛋白的表达和线粒体定位;利用荧光探针标记法检测TNF-α处理后L929-A细胞内的活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平、胞内钙离子浓度、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）及三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）浓度,应用试剂盒检测线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ的活性变化;采用RIP1激酶特异性抑制剂坏死抑素1（necrostatin-1,Nec-1）和Bid基因敲除的L929-A细胞评估RIP1激酶活性和Bid蛋白在介导细胞死亡中的作用。结果 RIP1、caspase-8和Bid蛋白均定位在线粒体外膜上;TNF-α处理后3 h即可诱导Bid剪切,伴随Bid剪切,线粒体呼吸链复合体功能检测显示复合体Ⅲ的活性受到抑制,MMP下降。TNF-α处理后6~12 h细胞内ROS升高、钙离子浓度上升、ATP浓度降低;抑制RIP1激酶活性或敲低Bid蛋白可完全拮抗TNF-α诱导的细胞毒性。结论 TNF-α通过诱导RIP1激酶活性依赖的Bid剪切,继而抑制线粒体呼吸链和细胞能量代谢,诱导细胞死亡。