一种用于肌腱二级纤维束及周围腱内膜形态观察的扫描电镜制样方法研究

摘要

目的探讨一种用于肌腱二级纤维束及周围腱内膜形态观察的扫描电镜制样方法。方法以猪趾浅屈肌腱为例,将肌腱在常温下横切为1 cm左右的肌腱段,通过双光子荧光显微镜观察组织完整性,行冰冻切片联合特殊Masson染色,观察肌腱二级纤维束及周围腱内膜分布情况。另取肌腱段若干经10%中性甲醛固定4 h,分为5组,采用不同的扫面电镜制样方法:A组,单纯梯度脱水;B组,行冰冻切片,再将肌腱切片进行梯度脱水;C组,梯度脱水至70%,行冰冻切片,再将肌腱切片进行梯度脱水;D组,梯度脱水至80%,行冰冻切片,再将肌腱切片进行梯度脱水;E组,梯度脱水至100%,行冰冻切片。各梯度脱水试剂为乙醇配制,梯度脱水终浓度均为100%。冰冻切片厚度均为100μm。经临界点干燥喷金后行体视显微镜和扫描电镜观察。结果双光子二次谐波显微成像观察示肌腱结构完整连续。Masson染色观察示周围腱内膜较薄区域难以辨别独立胶原纤维束。体视显微镜观察示肌腱切片电镜制样后大体完整,三级纤维束的周围腱内膜清晰可见。扫描电镜观察示A、D、E组肌腱组织呈现不同程度的过度收缩,二级纤维束结构无法辨别;B组整体呈现无规律的冰晶空隙,二级纤维束结构难以辨认,胶原纤维排列清晰可见;C组连续完整,二级纤维束及其周围腱内膜、胶原纤维排列均清晰可见。结论扫描电镜的肌腱试样制备,可通过组织固定后经乙醇梯度脱水至70%,行冰冻切片,再将肌腱切片继续梯度脱水至100%,该方法能清晰观察到肌腱二级纤维束及周围腱内膜的形态。