白消安处理消融猪内源精原干细胞的效果及外源精原干细胞移植

摘要

[目的]研究猪睾丸组织注射白消安消融猪内源精原干细胞(Spermatogonialstemcell,SSC)的效果,以及猪SSC同种异体移植后对内源性SSC消融受体生殖能力恢复的影响.[方法]采用3 mg/kg剂量的白消安对9头6周龄大白公猪进行睾丸注射,另外3头注射2 mL二甲基亚砜作为对照.3周后,对试验组公猪以相同剂量进行第2次睾丸注射.第2次注射3周后,采集试验组和对照组公猪睾丸进行相关检测,评估内源性SSC消融情况.第2次白消安注射1个月后,以两步酶消化法处理5～7日龄大白仔猪睾丸分离得到睾丸单细胞悬液,并用明胶差速贴壁法进行纯化,纯化后以免疫荧光和流式细胞术分析SSC的纯度.异体移植SSC 4个月后,用微卫星标记检测受体公猪精液以及睾丸组织中供体来源SSC的存在.[结果]以3 mg/kg剂量的白消安处理大白公猪2次后,睾丸组织苏木精?伊红染色以及免疫组织化学染色结果显示,试验组睾丸曲细精管中各级生精细胞消融但其支持细胞结构完好,可以支持外源性SSC的定植及发育.免疫荧光以及流式细胞术结果表明,分离得到的睾丸单细胞悬液经纯化后UCHL-1阳性细胞占比由差速贴壁前的16.3％提高到了50.8％.苏木精?伊红染色以及免疫组织化学染色结果显示,猪SSC移植4个月后,移植组睾丸组织生精细胞恢复,在受体睾丸曲细精管基底膜上可检测到UCHL-1阳性SSC.受体睾丸组织的微卫星标记分析显示了供体SSC的存在,表明移植进入受体睾丸中的供体SSC可以在受体睾丸中定植存活超过4个月;精液微卫星标记未检测到供体来源的精子.[结论]以3 mg/kg剂量的白消安注射公猪睾丸能有效消融内源性SSC,可以用来制备SSC移植的受体猪.两步酶消化及明胶差速贴壁法可成功分离纯化猪SSC.猪SSC经同种异体移植后可以在受体睾丸中定植存活超过4个月.