phCMV1和pcDNA3表达人绒毛膜促性腺激素β-C3d3融合蛋白的表达效率比较

摘要

目的比较真核表达载体phCMV1和pcDNA3在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达人绒毛膜促性腺激素β(hCGβ)-C3d3融合蛋白的表达效率,以获得hCGβ-C3d3融合蛋白的高效表达.方法利用高效真核表达载体phCMV1, 构建带有6个组氨酸纯化标签的融合蛋白表达质粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3;脂质体法介导phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和pcDNA3-hCGβ-C3d3转染CHO细胞,G418 (800 μg/ml)筛选抗性克隆,G418 (300 μg/ml)维持培养、扩增,待阳性克隆95%汇片时换用无血清培养基培养.放射免疫法检测hCGβ表达量,Western blot鉴定表达产物,Raji细胞免疫化学染色法鉴定hCGβ与C3d分子的成功融合.反复冻存和复苏高效表达hCGβ-C3d3融合蛋白的阳性克隆,比较表达效率的变化.用镍柱和凝胶过滤层析纯化表达产物. 结果酶切鉴定及测序证实phCMV1-6His-hCGβ-C3d3构建正确,并成功地在CHO细胞中获得了6His-hCGβ-C3d3融合蛋白的表达.无血清培液中24、48、72 h融合蛋白的表达量分别为496、527、633 mIU/ml/1×106细胞(以hCGβ含量计算),phCMV1比pcDNA3载体的表达效率高1.4倍.3次冻存和复苏高效表达hCGβ-C3d3融合蛋白的阳性克隆,表达效率无明显变化.表达产物经纯化后获得了所需的hCGβ-C3d3融合蛋白. 结论 phCMV1表达hCGβ-C3d3融合蛋白的效率高于pcDNA3;用6His纯化标签可以成功纯化获得hCGβ-C3d3融合蛋白.