人TEFM基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果鉴定

摘要

本研究旨在构建人TEFM基因的shRNA真核表达载体,对其抑制效率进行鉴定,以筛选出抑制效率最优的shRNA干扰载体.根据人TEFM基因全长cDNA序列(NM_024683.3),利用Ambion公司在线软件设计出4条shRNA,分别克隆至psi-U6载体中,得到4个重组干扰质粒TEFM-shRNA-1~TEFM-shRNA-4.重组子转化感受态细胞后挑取阳性克隆子进行PCR鉴定和DNA测序验证.将4个shRNA真核表达载体分别转染人脑胶质瘤U87细胞,使用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株后,通过qPCR和Western blotting分别检测各组细胞中TEFM的mRNA和蛋白质表达水平.PCR鉴定和DNA测序鉴定证实重组质粒中已插入目的DNA序列.qRT-PCR和Western blotting结果表明,4个重组载体均可以显著降低TEFM的mRNA和蛋白质表达水平(P<0.01),其中以TEFM-shRNA-3和TEFM-shRNA-4的抑制效率最优,对TEFM mRNA表达的抑制率分别为76.5%和78.8%,TEFM蛋白表达的抑制率分别为69.5%和74.8%.成功构建TEFM基因shRNA真核表达载体,转染人脑胶质瘤U87细胞并成功筛选出稳定沉默细胞株,为进一步探索TEFM在脑胶质瘤中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础.