CSF2A融合基因真核表达载体的构建及其对EBV+肿瘤细胞增殖和凋亡的影响

摘要

目的:构建爱泼斯坦-巴尔(EB)病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A (LMP2A)基因与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合基因(CSF2A)重组真核表达载体,探讨CSF2A融合蛋白对EBV阳性(EBV+)肿瘤细胞增殖和凋亡的影响.方法:根据重叠延伸原理,将LMP2A与GM-CSF在编码(Gly4Ser)3多肽的DNA基因片段连接下进行重组.采用DNA重组技术将融合基因片段连接于pIRES2-eGFP真核表达载体上,行酶切电泳分析和DNA测序鉴定重组质粒.设pIRES2-CSF2A重组质粒转染组为实验组,pIRES2-LMP2A质粒转染组和pIRES2-eGFP空质粒转染组为对照组,分别转染树突状细胞(DC).采用RT-PCR和Western blotting法检测细胞中CSF2A基因和蛋白表达;MTT和Hochest法检测各组EBV+肿瘤细胞增殖抑制率和细胞凋亡形态学.结果:酶切实验和序列测定,CSF2A融合基因正确插入pIRES2-eGFP质粒,并成功获得重组真核表达载体plRES2-CSF2A.转染pIRES2-CSF2A至DC后,检测到CSF2A蛋白的表达.MTT法检测,pIRES2-CSF2A质粒转染组细胞增殖抑制率高于对照组(P＜0.05或P＜0.01),且呈时间依赖性;Hochest检测,细胞出现凋亡形态学改变并产生凋亡小体.pIRES2-CSF2A质粒转染组作用于EBV+肿瘤细胞48 h时凋亡细胞明显增多.结论:重组真核表达载体pIRES2-CSF2A可有效转染DC,并明显抑制EBV+ CNE2细胞增殖且促进其凋亡.