人降钙素原的原核表达及其单克隆抗体的制备

摘要

目的:原核表达人降钙素原(procalcitonin,PCT)重组蛋白,制备高纯度的PCT单克隆抗体。方法:将构建的PCT-pET22b表达载体转入大肠埃希菌BL21中诱导表达PCT蛋白,经Ni-NTA亲和层析法纯化,用蛋白质印迹法和胶体金法对其进行鉴定。获得的PCT重组蛋白采用长程免疫法皮下多点注射Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,筛选阳性杂交瘤细胞株并进行亚克隆4次。将细胞株注入小鼠腹腔收集腹腔积液获得单克隆抗体,经辛酸硫酸铵法和Protein G亲和层析法进行纯化。结果:SDS-PAGE电泳结果显示在相对分子质量约14 k Da处有一明显条带,与目的蛋白大小相符。蛋白质印迹法和胶体金法证明该可溶性蛋白为PCT。采用细胞融合技术成功筛选出7株阳性杂交瘤细胞,将其命名为B3,C4,C7,E9,F8,F10,G2。选B3和C4细胞株通过体内诱生法制备单克隆抗体,经纯化后纯度可达95%以上。间接ELISA法检测B3、C4抗体效价均可达10~7,亲和常数分别为5.06×10^8,7.3×10^8。结论:获得高纯度的PCT重组蛋白及其单克隆抗体,为PCT检测试剂盒的进一步研究提供了支持。