血管基膜衍生多功能肽基因在毕赤酵母中的表达和活性鉴定

摘要

目的:利用PCR技术从含有目的基因的质粒pGEX-4T-1-VBMDMP获得带有SnabⅠ和NotⅠ酶切位点并融合有GST的目的基因片段并测序鉴定,将PCR产物纯化、酶切、回收,克隆到pPIC9K载体,转化入大肠杆菌DH5a扩增,用琼脂糖凝胶电泳,限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定.方法:Bgl Ⅱ线性新构建的表达载体pPIC9K-GST-VBMDMP,然后用原生质体转化法转化毕赤酵母细胞,并用pPIC9K空质粒也转入酵母细胞进行对照.用煮-冻-煮法裂解已转化有目的基因的毕赤酵母细胞提取DNA并行PCR鉴定,获得阳性重组子,行多克隆筛选和表型鉴定.筛选His+Muts表型的转化子,在MGY液体培养基中30℃摇床培养,每24 h从培养基中转移1 ml培养基上清于-70℃保存,并保持培养瓶中培养基的量和培养基中甲醇0.5%的浓度不变,8 d后行SDS-PAGE检测表达的蛋白,用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化获得GST-VBMDMP融合蛋白;用凝血酶切割GST-VBMDMP并分离获得VBM-DMP.结果:发现VBMDMP能够抑制鼠主动脉内皮细胞管状结构的形成;同时(VBMDMP 10 mg/kg,6 mg/kg,2 mg/kg)对小鼠Lewis肺癌原发瘤具有显著抑制作用(瘤重抑制率分别为96.6%,82.1%,61.2%).VBMDMP(GST-VBMDMP 10 mg/kg,6 mg/kg,2 mg/kg)对小鼠Lewis肺癌自发性肺转移具有显著抑制作用(自发性肺转移瘤结节抑制率分别为96.8%,87.9%,75.3%).结论:VBMDMP能够抑制鼠主动脉内皮细胞管状结构的形成,并对小鼠Lewis肺癌原发瘤和肺转移具有明显的抑制作用.