嗜热厌氧杆菌 Ana. Pif1解旋酶核心结构域蛋白与DNA底物结合的反应特性

摘要

目的： 探究嗜热厌氧杆菌的 Ana. Pif1解旋酶核心结构域蛋白（ Ana. Pif1-HD）与DNA底物结合的反应特性。 方法： 利用DNAman、CluxtalX等软件，对 Ana. Pif1的核心结构域蛋白进行系统进化树分析与同源序列比对； Ana. Pif1-HD表达载体构建后转入大肠杆菌进行原核表达，并通过Ni-NTA、SUMO酶切、S200分子筛等层析柱纯化获得 Ana. Pif1-HD蛋白；利用Stopped-flow FRET技术监测 Ana. Pif1-HD蛋白的解旋活性，利用荧光偏振检测技术分析 Ana. Pif1-HD与不同长度、不同结构DNA底物的结合反应各向异性值，并进行拟合分析与统计。 结果： Ana. Pif1的核心结构域蛋白为靠近N-端的448氨基酸，通过原核表达与纯化获得纯度为97%、浓度为 5 g/L 的 Ana. Pif1-HD蛋白，并利用Stopped-flow FRET与荧光偏振等技术验证其具有 Ana. Pif1全长蛋白90%的解旋活性与95%的结合活性； Ana. Pif1-HD的最佳结合反应条件是42 ℃在pH 6.0含20 mmol/L NaCl及 3 mmol/L MgCl 2的溶液中进行； Ana. Pif1-HD与不同长度ssDNA底物结合时的解离速率常数递增，并明确其ssDNA的binding-size为10.34 nt；研究首次揭示 Ana. Pif1-HD与不同复制中间体DNA结合反应的底物特异性ss-G4 DNA〉G4 DNA〉3′-ssDNA-dsDNA ≈ Y-型〉其它底物。 结论： 成功表达纯化具有全长活性的 Ana. Pif1解旋酶核心结构域蛋白，首次揭示该解旋酶核心蛋白与各类不同DNA底物的结合反应特性。