人瘦素基因的原核表达载体构建及其蛋白结构分析

摘要

目的克隆人源Leptin的成熟肽编码序列后基因并构建其原核重组表达菌株,对其产物进行纯化鉴定;生物信息学分析其蛋白质结构并预测功能。方法提取人脂肪干细胞中的总RNA,经RT-PCR反转录获得c DNA序列,PCR扩增Leptin基因并将其克隆入表达载体p ET-28a（＋）原核质粒,构建该基因的重组原核表达载体p ET-28a-Leptin。随后进行双酶切和测序鉴定。在E.coli BL21（DE3）中诱导表达目的蛋白,通过WB检测Leptin蛋白的表达;利用在线网络生物信息学相关数据库和分析软件对测序结果进行分析,并对重组蛋白结构及功能等进行验证和预测。结果 PCR扩增得到Leptin目标DNA片段;成功构建重组表达质粒p ET-28a-Leptin,经IPTG诱导表达后,目的蛋白在宿主E.coli BL21（DE3）中高效表达Leptin融合蛋白,相对分子质量18 000。生物信息学检索该基因编码蛋白的氨基酸序列与理化参数显示,蛋白无跨膜区,有6个Ser、1个Thr可能为蛋白激酶磷酸化位点,第1~21位可能为信号肽区域。在Leptin氨基酸序列中：α-螺旋93处,无规则卷曲43处,延伸链17处,β-转角14处,分别占总二级结构的55.69%、25.75%、10.18%和8.38%。结论成功克隆了人的Leptin基因。利用原核载体表达系统成功表达并进一步纯化的Leptin蛋白具有免疫原性。其生物信息学分析及结合蛋白质结构与功能预测结果可为深入研究Leptin蛋白的活性作用提供有益借鉴。